第二三节凝胶过滤与高效液相色谱演示文稿.ppt

第二三节凝胶过滤与高效液相色谱演示文稿11页，共100页，星期二2（优选）第二三节凝胶过滤与高效液相色谱2页，共100页，星期二3页，共100页，星期二优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点回收率高等特点适用于：适用于：a.a.分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质( (包括酶类包括酶类) )、核酸、多糖、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质激素、氨基酸和抗生素等物质b.b.测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量c.c.样品的浓缩和脱盐等方面样品的浓缩和脱盐等方面4页，共100页，星期二一、凝胶的分类及性质一、凝胶的分类及性质性质：性质： 凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛功能子筛功能分类：分类： 葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯酰葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶( (生物胶生物胶) )和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝胶等5页，共100页，星期二6页，共100页，星期二一）（一） 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶商品名：商品名：SephadexSephadex，它是由葡聚糖，它是由葡聚糖 右旋糖酐右旋糖酐(G(G型型) )；和；和3-3-氯氯-1,2-1,2-环氧丙烷（交联剂环氧丙烷（交联剂) )以醚链相以醚链相互交联而成的。

在交联葡聚糖互交联而成的在交联葡聚糖G-25G-25和和G-50G-50中分中分别加入羟丙基基团反应，即可构成别加入羟丙基基团反应，即可构成LHLH型烷基化型烷基化葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶7页，共100页，星期二8页，共100页，星期二9页，共100页，星期二1 1理化性质理化性质葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其表面的网状皱纹它带有大量的羟基，亲水其表面的网状皱纹它带有大量的羟基，亲水性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀不性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀不同型号的葡聚糖凝胶的交联度同型号的葡聚糖凝胶的交联度( (交联剂在葡聚糖交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数凝胶中占的百分数) )不同，使其在水中的膨胀度不同，使其在水中的膨胀度( (床体积床体积) )、吸水量、吸水量( (每克干凝胶在水中充分膨胀每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量但不包括颗粒间所带的水量时所需的水量但不包括颗粒间所带的水量) )、筛孔的大小和分组范围有明显的差异筛孔的大小和分组范围有明显的差异10页，共100页，星期二11页，共100页，星期二例如，例如，Sephadex G-25Sephadex G-25比比G-100G-100交联度大。

而交联度大而膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，即在即在1000(1000(下限下限)-5000()-5000(上限上限) )之间，而后者的之间，而后者的分级范围较宽，即在分级范围较宽，即在4000-1500004000-150000之间12页，共100页，星期二本质：本质：葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程度并不影响样品的分级效果但盐溶液或清洁度并不影响样品的分级效果但盐溶液或清洁剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效果葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同13页，共100页，星期二1 1）以）以G G型葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶( (经水溶液膨胀经水溶液膨胀) )作为固作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析葡聚糖凝胶过滤层析2 2）以）以LHLH型葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶( (经乙醇或二甲亚砜甲经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或酰胺或N,N-N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀) )作作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层葡聚糖凝胶渗透层析析。

14页，共100页，星期二2 2稳定性稳定性葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)(120)消毒消毒3030分钟，其性质并不改变在分钟，其性质并不改变在0.1mol/L HCl0.1mol/L HCl溶液中浸泡溶液中浸泡1-21-2小小时，甚至在时，甚至在0.02mol/L HCl0.02mol/L HCl溶液中浸泡溶液中浸泡6 6个月以上，对分离效个月以上，对分离效果无明显的影响果无明显的影响耐酸、耐碱、耐高温耐酸、耐碱、耐高温15页，共100页，星期二但当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水但当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水解断裂，要避免与其接触葡聚糖凝胶欲在室温解断裂，要避免与其接触葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐下长期保存时，应加入适量的防腐剂如剂如剂如剂如氯仿、叠氯仿、叠氮化钠氮化钠等否则，微生物将生长否则，微生物将生长16页，共100页，星期二。

3 3吸附性吸附性葡聚糖凝胶系弱酸性物质葡聚糖凝胶系弱酸性物质, ,由于其每克干胶中含由于其每克干胶中含10-2010-20微克当量的羧基基团所致该基团能与分微克当量的羧基基团所致该基团能与分离物中电荷基团离物中电荷基团( (尤其是碱性蛋白质尤其是碱性蛋白质) )发生吸附作发生吸附作用但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度用但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度解决当离子强度大于解决当离子强度大于0.050.05时，一般对弱碱性蛋时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了因此葡聚糖凝胶层析时白质就无吸附力了因此葡聚糖凝胶层析时, ,常常用含有用含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液的缓冲液作洗脱液17页，共100页，星期二新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力了虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋了虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响层析，以便消除其影响18页，共100页，星期二。

此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸吸附原理附原理，而不是排阻原理而不是排阻原理19页，共100页，星期二二）琼脂糖凝胶（二）琼脂糖凝胶琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称称Sepharose,Sepharose,美国称美国称Bio-gel ABio-gel A；英国称；英国称SegavacSegavac；丹麦；丹麦Gelarose,Gelarose,我国的同类产品与瑞典相同，我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除这些琼脂糖中除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售凝胶形式出售20页，共100页，星期二琼脂糖凝胶按其浓度分：琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B(2Sepharose 2B(2浓度浓度) )、4B(44B(4) )和和6B(66B(6) )Sepharose 6BSepharose 6B的机械强的机械强度大于度大于2B2B，但是筛孔小于，但是筛孔小于2B2B。

琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些21页，共100页，星期二三）聚丙烯酰胺凝胶（三）聚丙烯酰胺凝胶商品名商品名Bio-gelBio-gel是以甲撑双丙烯酰胺（双体）是以甲撑双丙烯酰胺（双体）作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）为加速剂，）为加速剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成的当改变单体浓将丙烯酰胺（单体）聚合而成的当改变单体浓度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有Bio-gel P-2Bio-gel P-2到到P-300P-30022页，共100页，星期二一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀胶形式出售，使用前必须溶胀特点：不溶于水和普通有机溶剂，特点：不溶于水和普通有机溶剂，能在浓盐、能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡尿素和胍盐等溶液中浸泡：在：在pH l-10pH l-10或短时或短时问超过此问超过此pHpH值的溶液中较稳定；要避免长期与值的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。

解（高温条件）缺点：缺点：对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服以克服23页，共100页，星期二24页，共100页，星期二25页，共100页，星期二四）四） SephacrylSephacrylSephacrylSephacryl由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共价交联制成的属硬性凝胶，具有一定大小的价交联制成的属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团筛孔和少量的羧基基团SephacrylSephacryl吸水时，其吸水时，其珠状颗粒直径平均值为珠状颗粒直径平均值为7070m m通常是用于水相通常是用于水相系统中若在有机相系统使用时，其孔径大小系统中若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化略有变化26页，共100页，星期二27页，共100页，星期二特点：特点：1.在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；2.它可在它可在pH2-11范围内使用，当范围内使用，当pHpH低时，葡聚糖低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；在链将发生少许水解作用；在0.2mol/L NaOH溶液溶液中中(室温下室温下)处理处理100100小时小时,对其低流速和多孔性没对其低流速和多孔性没有明显影响。

有明显影响3.用清洁剂用清洁剂(如如如如SDS)SDS)、6mol/L盐酸胍和盐酸胍和8 mol/L8 mol/L尿素尿素活液可作为洗脱剂活液可作为洗脱剂,高温（高温（120120）消毒）消毒(pH 7(pH 7时时时时) )处理后处理后,层析性质没各明显变化层析性质没各明显变化28页，共100页，星期二SephacrylSephacryl能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚糖能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚糖(Proteoglycans)(Proteoglycans)也可用硕大的病毒颗粒也可用硕大的病毒颗粒( (直径直径300-400) 300-400) 的的分离层析时，用细颗粒凝胶分辨率高层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。