白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠抗氧化能力的影响.pdf

重庆医科大学学生创新实验项目申 请 书项目名称：白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠抗氧化能力的影响申 请 者：廖冰洁、唐成莉、傅思华指导教师：单位：×××实验教学中心： 13667693959 申请日期：2011 年 12 月 13 日重庆医科大学实验教学管理中心研究项目项目名称白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠抗氧化能力的影响所属学科生物实验申请金额5400元起止时间2011年月至年月项目性质学生自选研究课题型科研小组成员姓名性别年级及电子邮箱廖冰洁女2010级13667693959 758839529@.com 傅思华女2010级13667693787 1215637915@.com 唐成莉女2010级13667693956 592697063@.com 指导教师研究内容和意义简介(400~500字) 乳腺炎 (Mastitis)是奶牛最常见的一种疾病， 是导致奶牛业损失最严重的疾 病之一不仅严重制约了奶牛业的发展，同时也威胁着人类的健康目前，防 治奶牛乳腺炎的方法很多，其中抗生素一直是乳腺炎治疗的主要手段，但长期 大量使用抗生索引发了许多新的问题，如耐药菌株增加、乳中抗生素残留等 近年来，提高奶牛的天然抗病能力和奶牛乳腺炎的非抗生素疗法，已成为国内 外学者研究的热点。

白藜芦醇 (trans —resveratro1，RES) 属于非黄酮类多酚化合物， 广泛存在 于种子植物中，在葡萄皮中含量最高白藜芦醇的结构中有三个酚羟基，在机 体中可以竞争性结合自由基，从而减少自由基含量，达到清除自由基的作用 而发生乳腺炎时机体的抗氧化机能受到破坏，理论应有白藜芦醇能提高机体的 抗氧化能力，从而降低乳腺感染的风险丙二醛(malon—dialdehyde ，MDA) 、 超氧化物歧化酶 (superoxide dis —mutase，SOD) 是检测自由基的重要参数大 量研究表明，机体在炎症发生时，血清SOD 活力下降， MDA 含量有所上升 本实验通过给大鼠灌喂不同剂量的白藜芦醇，探究白藜芦醇对内毒素诱发 的试验性乳腺炎大鼠的抗氧化能力的影响，从而探究白藜芦醇对乳腺炎的作用 如果白藜芦醇具有抑制乳腺炎的作用，那么，既可以开发奶牛饲料添加剂用以 防治奶牛乳腺炎的发生，从而为奶牛乳腺炎的防治提供一条新的思路和一定的 理论依据，以促进奶牛业的发展又可以利用葡萄皮提取其有效成分用于临床 防治乳腺炎，为临床乳腺炎的研究提供新方向一、立论依据( 项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献) 自由基是指分子、原子或基团中有不配对电子的一类物质，因为他们都具有氧原子 或氧分子，故又称为活性氧或氧自由基(R0S)。

其反应能力特别强，可以攻击生物膜和 组织的脂质、蛋白质机体在代谢过程中产生的活性氧及其他氧自由基能攻击生物膜 磷脂中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物，脂质过氧化物 在过氧化条件下是不稳定的，能分解生成有细胞毒性的丙二醛(MDA)，损伤组织细胞 炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应，病原菌一旦侵入乳腺，中 性粒细胞（ PMN ）和巨噬细胞即被动员起来，向乳腺移动，并吞噬这些侵入细菌这时 会出现氧消耗急剧增加的“呼吸猝发”现象，活性氧生成也随之增加，继而引发自由 基反应，参与杀灭被吞噬的病原菌由此可见，中性粒细胞在吞噬细菌的过程中，细 胞内会随之生成大量的过氧化物质虽然，这些过氧化物质也参与杀灭细菌，但它也 会对细胞和组织带来损伤， 破坏细胞的正常结构， 而且酶促反应产生的羟自由基(‘OH) 可导致溶酶体的溶细胞作用以及细胞膜脂质过氧化作用，使炎症进一步加重中性粒 细胞(PMN) 是乳腺中最重要的防御细胞，与炎症的发生及乳腺的保护密切相关PMN 的 杀菌作用主要是通过氧依赖过程实现的， PMN 通过释放大量高毒性的活性氧( 如O 、 H 0： 、 HOC1 等) 共同发挥杀菌作用。

但是发生乳腺炎时机体的抗氧化机能遭到破坏，大量高 毒性的活性氧在杀灭病原微生物的同时也会引起组织损伤正常情况下，机体的抗氧 化能力与不断产生的氧自由基的氧化能力之间保持着动态平衡，不会引起组织损伤， 若自由基产生异常增多或机体的抗氧化能力下降，将导致组织的氧化损伤，引发疾病 有实验表明乳腺炎奶牛机体存在自由基蓄积，并处于过氧化状态这是由于奶牛乳 腺受到感染，产生炎症时，中性粒细胞、吞噬细胞汇集到乳腺吞食入侵细菌，出现氧 消耗剧增，活性氧生成增加，由于代谢过程中产生的大量活性氧能够攻击生物膜中的 多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物及其分解产物MDA ，导致机 体及其乳腺组织细胞受到一定氧化损伤而且证实了乳房炎奶牛乳腺组织受到氧化损 伤，自由基参与了乳腺炎的发生过程 当给机体灌注一定剂量的细菌内毒素，机体的抗氧化活性下降， 而PMN释放大量的 活性氧则造成组织细胞代谢紊乱，结构和功能异常丙二醛（MDA ）作为脂质过氧化 代谢的产物，其水平高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，总超氧化物歧 化酶（ SOD)能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤，其水平的高低可间接反映机体清 除自由基的能力。

大量研究表明， 机体在炎症发生时， 血清SOD活力下降， MDA 含量 有所上升所以理论上当给大鼠灌喂白藜芦醇时机体的血清SOD活力应上升， MDA 含 量应有所下降 白藜芦醇 (trans —resveratro1，RES) 在1940年首次发现白藜芦醇， 20世纪70年代 首次发现葡萄中含有这种物质，后来 人们发现虎杖、花生、桑椹等植物中也含有这种成分天然白藜芦醇是一种天然活性成分，它能以游离态 (顺式、反式 ) 和糖苷结合态 (顺式、反式 )2种形式在植物 (如中药 材虎杖 )中分布及生物合成，且均具有抗氧化效能，其中反式异构体的生物活性强于顺 式，是葡萄中的一种重要的植物抗毒素20世纪80年代，世界卫生组织调查发现，尽 管法国人偏爱奶酪等高脂肪食物，但冠心病发病率和死亡率低于其他西方国家，其原 因可能是与法国人常饮含白藜芦醇的葡萄酒有关此后，白藜芦醇备受关注 研究表明，白藜芦醇 (trans —resveratro1)具有抗癌、抗炎、抗菌、调节血脂， 影响骨代谢，预防心血管疾病等生物学作用.同时体外实验表明白藜芦醇具有抑制自由 基水平上升，减轻氧化损伤的作用在正常机体内会有少量的自由基存在，病理状态 下，自由基含量会增加，直接造成细胞各成分损害，引起其代谢和功能障。

白藜芦醇 (trans —resveratro1)属于非黄酮类多酚化合物，广泛存在于种子植物中．结构中有 三个酚羟基，在机体中可以竞争性结合自由基，从而减少自由基含量，达到清除自由 基的作用 在一定浓度范围内，白藜芦醇有较强的清除自由基和抑制脂质过氧化的作用，能 提高和诱导生物体内抗氧化酶类如SOD 的活性来消除体内的过量自由基，抑制自由基反 应所致的过氧化脂质 (终末产物 MDA) 的生成所以当灌喂白藜芦醇给内毒素诱发乳腺炎 的大鼠时，血清 SOD 的活力应提高， MDA 含量应有所降低 既然白藜芦醇具有抗氧化能力，而乳腺炎时机体的抗氧化能力下降，故理论上白 藜芦醇应对乳腺炎有预防作用本实验过程中，将对内毒素诱发的乳腺炎大鼠灌喂不 同剂量的白藜芦醇， 再检测大鼠乳腺组织和血清丙二醛(MDA) 、 总超氧化物歧化酶（SOD ） 的含量变化，从而的出白藜芦醇对内毒素诱发乳腺炎的大鼠的影响如果实验成功， 那么将对奶牛乳腺炎的发生有一定的预防作用，提高奶牛业的经济效益，而且也可用 于人类乳腺炎的临床研究，为药物的研究方面提供一定的理论依据二、研究方案研究目标?1、探讨白藜芦醇对内毒素（ LPS ）诱发的试验性乳腺炎大鼠抗氧化机制的影响。

?2、探讨白藜芦醇是否能通过提高机体自身的抗氧化能力而降低乳腺感染的风 险研究内容为研究视黄醇对内毒素诱发乳腺炎大鼠的抗氧化能力的影响，将40只孕鼠随机分为 正常对照组 (Con，n=8)、阳性对照组 (P，n=8)和试验组 (T，n=24)自怀孕第 10天起， 试验组分别灌喂视黄醇 ( 溶解于大豆油 )4 000 IU ／(kg ’d)(L ，n=8)、8 000 IU ／ (kg ·d)(M，n=8)、16 000 IU ／(kg ·d)(H ，n=8)，对照组灌喂等量的大豆油，连续10 d产后 72 h分别灌注灭菌生理盐水 (Con组) 和10 g大肠杆菌内毒素 (Escherichia coli endotoxin ，LPS)(P和T组) 到大鼠第 4对乳腺内， 12 h处死大鼠，收集血清及乳腺组织 通过观察乳腺组织病理切片和测量血清中丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶 (T—SOD) 、 总抗氧化能力 (T—AOC) 的含量，来探究白藜芦醇是否对内毒素诱发的大鼠乳腺炎有抗 氧化作用理论上应有白藜芦醇可以通过改善机体的抗氧化机制，对LPS 诱发的试验性 大鼠乳腺炎发挥一定的预防作用。

研究方法1、试验动物 60只清洁级健康 SD 大鼠，其中雌鼠 40只，体重 260～300 g，均未孕；雄鼠 20只，体重 350～400 g适应性饲养 1周后，将雌鼠与雄鼠按 2：1同笼饲养，使之交配受孕大鼠 确认怀孕后，随机分为正常对照组 (C)(n=8) 、 阳性对照组 (P)(n=8) 和试验组 (T)(n ： 24) 怀孕第 1O 天起，开始灌喂白藜芦醇(溶解于大豆油中 ) J ，连续 10 d；试验组分为 3个剂 量亚组，分别灌喂白藜芦醇4 000 IU ／(kg*d)( 低剂量， L)、8 000 IU ／(kg ·d)( 中剂 量，M)、16 000 IU ／(kg ·d)( 高剂量， H)；对照组灌喂等量的大豆油大鼠产后72 h 经乳头管注入内毒素 10 g／侧到大鼠第 4对乳腺 (双侧) 内，正常对照组注入等量灭菌的 生理盐水 12 h后，颈静脉放血处死动物，收集血清，采集乳腺组织，部分中性甲醛 液固定，部分放入一 70℃中用于后续分析 2 、主要试剂 内毒素 (endotoxin)即脂多糖 (1ipopolysaccharide，LtX5) 由O ：B 血清型大肠杆菌分 离提纯，丙二醛 (MDA) 、总超氧化物歧化酶 (T—SOD) 、总抗氧化能力 (T—AOC) 检测试剂 3 、测定指标及方法 3-1： 组织匀浆及蛋白浓度的测定取适量乳腺组织按 1：6(m：V)加入生理盐水， 冰浴匀浆后以 12 000 r ／rain 于4℃离心 30 min ，收集上清一 20℃ 保存备用。

使用前 用Bradford 法测定蛋白浓度 3-2: 乳腺组织的病理组织学检查打开大鼠腹腔，观察乳腺病理变化，迅速取部 分乳腺组织固定于中性甲醛液中，石蜡包埋，切片，H．E．染色后光学显微镜下进行 病理组织学观察病理切片应观察到：对照组乳腺组织无可见病理变化，腺泡结构清 晰可见，腺泡腔内乳汁充盈；P组乳腺组织腺泡腔内乳汁分泌显著下降，腺泡壁皮细 胞肿胀、变性、出血严重，大量炎性细胞(以中性粒细胞为主 )浸润其中，致使腺泡结 构模糊难辨；试验组同阳性对照组相比，病变明显减轻，以L组和M 组效果较为明显，表现为 L组和M 组腺泡内仅见少量中性粒细胞浸润，乳汁分泌明显增多；H组乳腺组织内 有大量中性粒细胞浸润，腺泡壁上皮细胞肿胀、变性明显 3-3: 乳腺组织及血液抗氧化能力的测定用试剂盒分别检测 MDA 、 T—SOD 、 T—AOC 的含量各含量应有： 乳腺组织中， 同正常对照组相比， 阳性对照组 MDA 有升高的趋势， 灌喂视黄醇使 MDA 水平有所降低 (同阳性对照比 ) ，但差异均不显著；血清中，与正常对 照组相比，阳性对照组与试验组MDA 水平均无显著变化阳性对照组与试验组大鼠乳腺 组织中 MDA 均无显著变化，与正常对照组相比，P组、H组大鼠乳腺组织 T—SOD 活力显著 下降；与 P组相比， M 组大鼠乳腺。