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第三章第三章 利用生物合成原理利用生物合成原理 寻找微生物新药寻找微生物新药根据微生物药物的生物合成原理 发现微生物新药的方法和途径n通过非基因定向改变、基因定向改变， 以及组合生物催化的技术，或是改变原 有微生物药物的生物合成途径，或是对 原有的微生物药物（或先导化合物和中 间体）进行生物催化，以发现微生物新 药 .产生菌前体物质(1) 诱变处理化学 修饰天然产物 衍生物天然产物天然中间物天然产物 衍生物 阻断或非 阻断菌株定向与杂交生物转化与 组合生物转化 微生物或 酶转化天然产物 类似物杂合工 程菌突变生物 合成组合生物 合成(2) 基因操作天然产物 类似物(1)(2)天然产物 类似物定向与杂交 生物合成化学 修饰微生物药物生物合成 与微生物新药发现的基本途径 n通过非基因定向改变的方法包括：定向 生物合成、杂交生物合成、突变生物合 成，以及生物转化与组合生物转化；n基因定向改变，即为组合生物合成 第一节第一节 生物合成途径的非基因定向改变生物合成途径的非基因定向改变 与微生物新药的发现与微生物新药的发现一、非遗传操作的定向生物合成 与微生物新药的发现n已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生 物合成中酶－底物的特异性足以使结构相关的 代谢产物在其发酵液中积累；n但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性 ），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中 添加一些已知结构类似物作为前体物质，可以 产生含有与这种已知结构类似的新衍生物；n这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之 为非遗传操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。

前体（precursor）n即在微生物培养过程中，外源添加的某 一化学物质，通过微生物的代谢，能够 将其整体地或部分地整合到某一特定的 次级代谢产物的分子中去的化合物，如 苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）非遗传操作的定向生物合成n这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物 质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质 掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的 含有这种前体的产物的方法，即为非遗传操作 的定向生物合成n其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶 的底物专一性较差，而能使外源添加的某些前 体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去 定向生物合成与微生物新药的发现n次级代谢产物合成酶的特点：是一个由一系列酶参与催化的多酶体系 参与催化反应的酶的底物专一性比初级 代谢合成酶要差应用实例n应用非遗传操作定向生物合成的方法能 够制备获得许多新的抗生素，其中目前 已进行工业化生产的有：n青霉素G和V；n培罗霉素；n四环素和金霉素等 青霉素定向生物合成序号侧 链 R学 名俗 名1对羟基苄青霉素青霉素X2苄青霉素青霉素G3戊烯[2]青霉素青霉素F4戊青霉素青霉素二氢F5庚青霉素青霉素K6丙烯巯甲基青霉素青霉素O7苯氧甲基青霉素青霉素V84－氨基－4－羧基 丁基青霉素青霉素N青霉素和6－APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称青霉素分子的化学结构6－APA的化学结构各种天然青霉素具有的侧链和名称培罗霉素定向生物合成.培罗霉素定向生物合成 ——可结合进入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物.* PEP的末端胺基四环类抗生素的定向生物合成R5R6R76－去甲基四环素HHH(1) 7－氯－6－去甲基四环素HHCl(2)四环素HCH3H(3) 5－羟基四环素（土霉素）OHCH3H(4) 7－氯四环素（金霉素）HCH3Cl(5)微生物发酵产生的一些四环素类抗生素四环类抗生素的定向生物合成在生产金霉素时需添加氯化物作为前体 ，而当生产四环素时，则必须要在发酵 培养基中添加氯离子抑制剂，如溴化物 或M-促进剂等，从而抑制金霉素的合成 而得到四环素产物。

另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过 程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺 胺嘧啶钠，能够获得去甲基金霉素 非基因改变定向生物合成的研究进展尽管近年来基因改变的定向生物合成发 展很快，但利用非遗传操作定向生物合 成原理寻找新的生理活性物质的研究还 在不少实验室继续进行，特别是对一些 肽类如环孢菌素A、aureobasidins及糖 肽类如替考拉宁产生菌的定向生物合成 研究取得了很大的进展￿￿二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成 与微生物新药的发现n 杂交生物合成（hybrid biosynthesis）似乎可 以理解为是一种“强化”的非遗传定向生物合成 ，如在苦霉素产生菌发酵过程中添加聚乙酰途径 中β-酮酯酰基合成酶抑制剂—线兰菌素 (cerulenin)，使其失去合成苦霉素大环内酯苷 元(picronolide)的能力而只能合成糖基同时 在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元 (protylonolide)，使其与苦霉素生产菌产生的 糖基结合，得到一种被称之为M4365G1的杂合抗 生素(hybrid antibiotic) 杂交生物合成与微生物新药的发现葡萄糖1×CH3COOH6×CH3CH2COOH2×CH3COOH5×CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA－427NO.261ProtylonolidePicronolideDesosaminePicromycinβ －D－Desosaminyl Protylonolide（M4365G1）在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（S.sp.AM－4900 ） 与protylonolide 杂交生物合成M－4365G杂交生物合成产物工业化的可能性尽管通过杂交生物合成能够得到一 些新的抗生素，但由于所添加的浅 蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素 ，再则所添加的苷元的结构受到限 制，所以这种方法似乎没有很大的 实际意义。

三、非定向诱变的突变生物合成 与微生物新药的发现n突变生物合成（mutational biosynthesis） ：n突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理 等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产 物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养 阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合 成以获得新的次级代谢产物的过程n另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产 生新的次级代谢产物突变生物合成原理 ——阻断突变株的类型营养缺陷型突变株：由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了 突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次 级代谢产物因此，这类突变株也可以称为 初级代谢阻断突变株 独需型突变株：这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于 编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变 ，而使丧失了合成次级代谢产物的能力这 是突变生物合成所需要的突变株 双重阻断突变株：即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上， 也发生在编码次级代谢酶的基因上突变生物合成与微生物新药发现.野生型产生菌独需型突变株AB正常途径某抗生素阻断变株A阻断变株BAB+BA+ABABA，B为某一抗生素分子结构的两个部分AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物BA为发酵培养时添加的的结构类似物ABAB即为新的杂合抗生素利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理AB突变生物合成的 基本流程.出发菌株的选择 诱变处理阻断突变株筛选 琼脂块法选择有生理活力的突变株无生理活力的突变株 摇瓶复筛有生理活力的突变株无生理活力的突变株 区段合成产物，连接 酶等生化特性的研究有区段合成产物、无 连接酶等活性的突变 株有区段产物A有连接 酶等活性的突变株有区段产物B有连接 酶等活性的突变株发酵培养添加结构类似物A或B样品收集TLC、HPLC检测及制备结构检测突变生物合成产生的新抗生素.菌种抗生素特殊营营养增补补物新抗生素伊尼奥小单孢单孢 菌西梭霉素DOS链链霉胺等突变变霉素1等绛红绛红 小单孢单孢 菌庆庆大霉素DOS链链霉胺等2－羟羟基GM等红红霉素链链霉菌红红霉素Erythronolide8，8α － deoxyoleanolie未鉴别鉴别弗氏链链霉菌新霉素DOS链链霉胍等杂杂交霉素A，B加利利链链霉菌阿克拉霉素阿克拉酮酮紫红红霉酮酮等11－羟羟基阿克拉霉 素A 灰色链链霉菌链链霉素紫红红霉酮酮等2－脱氧链链霉胍streptomutin A卡那霉素链链霉菌卡那霉素DOS1－N－甲基－DOS等1－N－甲基－GM等雪白链链霉菌新生霉素氨基香豆氨基香豆素同系物未鉴鉴明核糖苷链链霉菌核糖霉素DOS1－N－甲基－DOS等1－N－甲基－ RSMC等 普拉特链链霉菌普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5－O－ mycaminosyl narbonolide 龟龟裂链链霉菌巴龙龙霉素DOS链链霉胍杂杂交霉素C巴龙链龙链 霉菌尼可霉素尿嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶尼可霉素Z等唐德链链霉菌红霉素生物 合成途径.丙酰CoA丙酰－S－ACP甲基丙二酰CoA甲基丙二酰－S－ACP丙酰－丙酰—S－ACP聚酮体途径6－脱氧红霉内脂B红霉内脂B＋TDP－L－碳霉糖葡萄糖TDP－D－葡萄糖3－O－碳霉糖基－红霉内脂TDP－脱氧氨基己糖＋红霉素D红霉素C红霉素A红霉素E红霉素B缩合酶突变株产生的 新蒽环类抗生素.RR1R2 道若霉素（原株产生）OCH3COCH3OH亚德里亚霉素（变株产生）OCH3COCH2OHOH13－双氢道若霉素（变株产生）OCH3CHOHCH3OH13－双氢洋红霉素OHCOCH3OH11－去氧道若霉素（变株产生）OCH3COCH2OHH11－去氧亚德里亚霉素（变株产生）OCH3CH2CH3HBaumycinA*（原株产生）OCH3CH2COCH3OHFeudomycin A（变株产生）OCH3CH2CH3OHFeudomycin BOCH3CH2COCH3OH突变株产生的一些新的次级代谢产物.原菌种原抗生素突变株产生的新抗生素普拉特链霉 菌普拉特霉素demycarosyl－普拉特霉素 9－dehydromycarosyle－普拉特 霉素波赛链霉菌 紫产色链霉 菌柔红霉素 烬灰红菌素阿霉素 烬灰红菌素X波赛链霉菌baumycinoxaunomycin棘孢小单孢 菌庆大霉素小诺霉素生金链霉菌四环素去甲基四环素生金链霉菌金霉素去甲基金霉素龟裂链霉菌土霉素去甲基土霉素吸水链霉菌carriomycincarromycinA我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素.2H2SO4庆大霉素和小诺霉素的化学结构抗生素R1R2分子式 硫酸庆庆大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O7·2H2SO4 硫酸庆庆大霉素C1aHNH2C19H39N5O7·2H2SO4 硫酸庆庆大霉素C2CH3NH2C20H41N5O7·2H2SO4 小诺诺霉素HNHCH3C20H41N5O7·2H2SO4四、原生质体融合与微生物新药的发现n微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生 物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体 ，然后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理 的（如电融合）或化学的(如聚乙二醇)或生物 的（如仙台病毒）助融条件，使双亲株的原生 质发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合， 尔后发生基因组间的交换，重组，进而可以在 适宜的条件下再生出微生物细胞壁，获得重组 子的过程。

n利用微生物原生质融合寻找新抗生素的基本原 理是来源于两种已知产生不同抗生素的产生菌 的融合子，有可能将它们的部分生物合成基因 整合在一起而产生新的杂合抗生素；另一个原 理是由于抗生素产生菌中存在着沉默基因，当 这些沉默基因受到外源物质刺激后，有可能被 激活而产生结构与亲株完全不同的新的抗生素 n应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲哚佐 霉素（indloizomycin）：其亲株为链霉素产生 菌灰色霉菌和天神霉素（istamycin）产生菌天 神链霉菌S. tenjimariensis第二节第二节 生物合成途径的基因定向改变生物合成途径的基因定向改变 与微生物新药的发现与微生物新药的发现组合生物合成 Combinatorial biosynthesisCombinatorial biosynthesis。