生物化学：04章核苷酸和核酸4.ppt

第九节第九节DNA的一级结构测定的一级结构测定和化学合成和化学合成一、一、DNA一级结构测定一级结构测定 （（DNA sequencing）） DNA的一级结构的一级结构: 多聚脱氧核苷酸多聚脱氧核苷酸链中脱氧核苷酸的排链中脱氧核苷酸的排列顺序列顺序————碱基序列碱基序列DNA碱基顺序测定的主要方法碱基顺序测定的主要方法•1975年，年，Sanger 加减法加减法•1977年，年，Sanger 双脱氧终止法双脱氧终止法•1977年，年，Maxam & Gilbert 化学断裂法化学断裂法1.双脱氧法双脱氧法(dideoxy method)或末端终或末端终止法止法(chain termination)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Sanger, F. , Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977).Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-7.a second Nobel Prize in Chemistry in 1980 DNA的生物合成的生物合成Ø参与参与DNA复制的主要物质复制的主要物质ü底物底物: dATP, dGTP, dCTP, dTTP（（dNTP））ü聚合酶聚合酶: DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase））ü模板（模板（template））: 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链ü引物（引物（primer））: 互补于模板链的寡核苷酸片段，互补于模板链的寡核苷酸片段， 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合Ø子链子链DNA延长的方向延长的方向: 5’→3’DNA生物合成的过程生物合成的过程DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸的掺入终止双脱氧核苷酸的掺入终止DNA链的合成链的合成测序体系测序体系*****(1-5%)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳检测*****+–变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Ø丙烯酰胺丙烯酰胺+双丙烯酰胺双丙烯酰胺→三维网状孔结构三维网状孔结构Ø变性剂变性剂: 尿素尿素电泳装置电泳装置放射自显影放射自显影 利用放射性同位素利用放射性同位素所发射出来的带电粒子所发射出来的带电粒子(α或或β粒子粒子)作用于感光作用于感光材料的卤化银晶体，从材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可用显影液显示，成为可见的可见的"像像"。

2.自动测序自动测序ØHood developed a prototype automated DNA sequencer in 1985 ØLeroy Hood (1938---) earned an M.D. From Johns Hopkins University in 1964 and a Ph.D. in biochemistry from the California Institute of Technology in 1968. ØHe won the 2003 Lemelson-MIT Prize for inventing four instruments: the DNA gene sequence and synthesizer, and the protein synthesizer and sequencer 2004荧光物质作为标记物荧光物质作为标记物CCGAATGCTGACGTA荧光物质标记双脱氧核苷酸荧光物质标记双脱氧核苷酸the Sanger Institute Team 55: Sequencing Facility3. 碱基序列测定的新方法碱基序列测定的新方法("Next generation" methods)Ø美国国家卫生研究院（美国国家卫生研究院（NIH）设立）设立 “Revolutionary Genome Sequencing Technologies”基金，目标基金，目标: 2009年，测年，测定一人全基因组序列只定一人全基因组序列只$10万，万，2014年，费用将降为年，费用将降为$1000。

ØWaston2007年年5月月31日获赠装有他本人完整基因组图谱数据日获赠装有他本人完整基因组图谱数据的的DVD光盘2个月，个月，$200万）万） ØPyrosequencing (焦磷酸测序焦磷酸测序, Biotage ) Ø454 Sequencing — a brand of sequencing by 454 Life Sciences, that dramatically expands pyrosequencing ØSequencing by hybridization ØNanopore sequencing ØPolony sequencing (聚合酶克隆聚合酶克隆 )4.DNA序列测定技术的应用序列测定技术的应用Ø生物基因组测序生物基因组测序: 人类人类30亿碱基对亿碱基对ØPCR产物分析产物分析Ø限制性酶切位点分析限制性酶切位点分析Ø蛋白质结构、功能预测蛋白质结构、功能预测二、DNA 的化学合成的化学合成 （DNA chemical synthesis）•亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法 （H. Gobind Khorana), 3’→5’→保保护5’-OH→碱基碱基氨基亚磷酸化合物活化氨基亚磷酸化合物活化3’-OH亚磷酸三酯中间物亚磷酸三酯中间物磷酸三酯磷酸三酯 第十节第十节基因和基因组基因和基因组一、基因与基因组的基本概念基因与基因组的基本概念 1．基因（．基因（gene））Ø经典生物学经典生物学: 基因是决定或影响生物体某一性基因是决定或影响生物体某一性状或某一表现型的染色体上的某一部分。

状或某一表现型的染色体上的某一部分Ø分子水平的定义分子水平的定义 ( Beadle and Tatum 1940年年 ) :基因是遗传物质上的一个片段，基因是遗传物质上的一个片段，“基因编码一基因编码一个酶个酶” 或或“基因编码一个蛋白基因编码一个蛋白”Ø基因的生物化学定义：基因的生物化学定义： 基因是为各种多肽链或基因是为各种多肽链或RNA顺序编码的顺序编码的DNA片段为肽链和片段为肽链和RNA编编码的基因称为码的基因称为结构基因结构基因起调节基因转录和表起调节基因转录和表达作用的达作用的DNA序列称为序列称为调节顺序调节顺序，它们可以是，它们可以是结构基因的起始和终止信号，也可以是影响结结构基因的起始和终止信号，也可以是影响结构基因转录启动和开闭的顺序，或者作为构基因转录启动和开闭的顺序，或者作为DNA本身复制和重组的识别信号本身复制和重组的识别信号 Ø基因也可以称为基因也可以称为顺反子顺反子，一个顺反子就是一个，一个顺反子就是一个基因 基因的大小基因的大小 基因的大小可以直接估算，生物体中肽链基因的大小可以直接估算，生物体中肽链的平均长度约为的平均长度约为350个氨基酸残基，所以每个个氨基酸残基，所以每个基因平均有基因平均有1050个碱基对。

个碱基对 基因组基因组 （（genome）） 一个细胞中，所有基因和基因间一个细胞中，所有基因和基因间DNA的总的总和称为基因组现在人们也把能独立传递遗传和称为基因组现在人们也把能独立传递遗传信息的病毒信息的病毒DNA，质粒，质粒DNA称为病毒基因组和称为病毒基因组和质粒基因组大肠杆菌基因组有质粒基因组大肠杆菌基因组有4,638,858 bp；；人类基因组人类基因组30亿亿bp 二、天然二、天然DNA分子的大小与顺序特征分子的大小与顺序特征1. 病毒病毒DNA分子分子Ø 病毒基因组可以由病毒基因组可以由RNA 组成，也可以由组成，也可以由DNA 组成组成, 一般只含其中一种几乎所有植物病毒和一般只含其中一种几乎所有植物病毒和某些细菌病毒，动物病毒是某些细菌病毒，动物病毒是RNA病毒ØRNA病毒基因组较小病毒基因组较小DNA病毒基因组分子量病毒基因组分子量变化较大（单链变化较大（单链/双链）Ø病毒病毒DNA在复制时可形成环状结构在复制时可形成环状结构bacteriophage T4an animal virus （（adenovirus ））a plant virus 基因组大约基因组大约9000核苷酸核苷酸一些细菌病毒的颗粒大小和一些细菌病毒的颗粒大小和DNA长度长度2.细菌染色体细菌染色体DNA和染色体外和染色体外DNA Ø细菌染色体细菌染色体DNA：：只含一个环形染色体，所有基只含一个环形染色体，所有基因几乎都是单拷贝。

因几乎都是单拷贝E.coli DNA 4.7×106 bp，周长，周长1.7mm ，为大肠杆菌细胞长度的，为大肠杆菌细胞长度的850倍编码4300蛋白质基因和蛋白质基因和115稳定稳定RNA的基因Ø细菌质粒细菌质粒DNA：：细菌胞内，染色体外遗传因子，细菌胞内，染色体外遗传因子，环状，分子量小，能在细菌细胞内独立复制；携环状，分子量小，能在细菌细胞内独立复制；携带遗传信息，赋予宿主遗传性状所带抗性基因带遗传信息，赋予宿主遗传性状所带抗性基因可使寄主菌产生抗性现代基因克隆的主要载体可使寄主菌产生抗性现代基因克隆的主要载体 质质粒粒可可以以作作为为载载体体将将外外源源基基因因引引入受体细胞入受体细胞3.真核细胞染色体真核细胞染色体DNA Ø线形线形DNA分子Ø人体细胞人体细胞DNA全长约全长约2m , 一成人全部一成人全部DNA长长2×1014m, 是地球周长的是地球周长的5×10 6 倍Ø真核细胞真核细胞DNA含有重复顺序（高重复顺序、中含有重复顺序（高重复顺序、中等重复顺序）等重复顺序） 人类染色体人类染色体真核生物细胞器中的真核生物细胞器中的DNAØ叶绿体和线立体叶绿体和线立体DNA是环形是环形DNA。

Ø线立体线立体DNA小于小于20,000bp，为线立体，为线立体 tRNA和和rRNA及少量线立体蛋白编码及少量线立体蛋白编码三、染色体三、染色体DNA的碱基顺序特征的碱基顺序特征•细菌细菌Ø单染色体单染色体Ø几乎单拷贝（几乎单拷贝（copy））•真核生物真核生物Ø重复序列重复序列 （（repeated sequence ））p高度重复序列（高度重复序列（highly repeated sequence））/卫卫星星DNA（（satellite DNA）：＜）：＜10bp，可重复百，可重复百万次万次 ，，10% p中度重复序列（中度重复序列（moderately repeated sequence）：）：150-300bp ，重复千余次，重复千余次 ，，20%p单一序列（单一序列（unique sequence）） Ø高度重复序列大多与着丝粒高度重复序列大多与着丝粒（（centromere）和端粒（）和端粒（telomere）相关）相关Ø着丝粒着丝粒—— 细胞分裂细胞分裂Ø端粒端粒—— 染色体稳定染色体稳定Ø间隔顺序间隔顺序外显子外显子(exon)、内含子、内含子(intron) 和剪接（和剪接（splicing）） u 外显子：外显子：编码片段编码片段u 内含子：内含子：非编码片段非编码片段u 剪接：剪接：从初级转录物中，剪掉内含子，将相从初级转录物中，剪掉内含子，将相 邻的外显子连接起来的过程。

邻的外显子连接起来的过程 人血清白蛋白人血清白蛋白第十一节第十一节DNA超螺旋和染色超螺旋和染色质结构质结构 拓扑学（拓扑学（topology））: 拓扑学用于研究一拓扑学用于研究一种物体在不断变形情况下的某些不变的性质种物体在不断变形情况下的某些不变的性质如：一个闭合环形如：一个闭合环形DNA分子在不切断分子在不切断DNA主链主链的情况下，不管这个的情况下，不管这个DNA分子怎样变形或弯曲，分子怎样变形或弯曲，它的拓扑学性质是不变的它的拓扑学性质是不变的 一、一、DNA的拓扑学的拓扑学(topology)结构结构Ø噬菌体噬菌体T2DNA长约长约50μm ØE-coli DNA 长约长约1mmØ人生殖细胞人生殖细胞DNA长约长约1m细胞内细胞内DNA以超螺旋形式存在以超螺旋形式存在超螺旋结构超螺旋结构DNA的超螺旋结构的超螺旋结构 (superhelix /supercoil)DNA双螺旋链再盘绕双螺旋链再盘绕/螺旋即形成超螺旋结构螺旋即形成超螺旋结构DNA复制或转录过程中可能涉及超螺旋复制或转录过程中可能涉及超螺旋意义意义 细胞内细胞内DNA都是以超螺旋形式存在的，都是以超螺旋形式存在的，超螺旋是超螺旋是DNA三级结构的重要特征。

三级结构的重要特征 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于变化及其调控对于DNA复制和复制和RNA转录转录过程具有关键作用过程具有关键作用1. 关于超螺旋结构的基本概念关于超螺旋结构的基本概念 超螺旋超螺旋DNA DNA是以双螺旋的形是以双螺旋的形式围绕着同一个轴缠绕的式围绕着同一个轴缠绕的当双螺旋当双螺旋DNA的这个的这个轴再轴再弯曲缠绕弯曲缠绕时，时，DNA就处于就处于超螺旋状态，超螺旋状态，DNA超螺旋超螺旋状态是结构张力的表现，状态是结构张力的表现，即即双螺旋的螺旋双螺旋的螺旋 欠旋引起张力的欠旋引起张力的缓解方式缓解方式形成超螺旋形成超螺旋约约10bp双链分离双链分离84bp连系数（连环数连系数（连环数 linking number L，，Lk）） 一个闭合环形一个闭合环形DNA分子的连系数，严格分子的连系数，严格地等于没有任何超螺旋情况的地等于没有任何超螺旋情况的DNA两条链以右两条链以右手方向相互缠绕的次数连系数具有拓扑学性手方向相互缠绕的次数连系数具有拓扑学性质，是个整数。

不管一闭合环形质，是个整数不管一闭合环形DNA分子如何分子如何缠绕或变形，只要两条缠绕或变形，只要两条DNA链不被切开，它的链不被切开，它的值不变右手螺旋，连系数定义为正值（值不变右手螺旋，连系数定义为正值（+），），左手螺旋，连系数定义为负值（左手螺旋，连系数定义为负值（-）ΔLk与与比连系差比连系差 σ ØΔLk = Lk–Lk0Øσ= (Lk–Lk0)/Lk0= ΔLk/ Lk0ØLk0 为为DNA分子处于松弛状态时连系数，分子处于松弛状态时连系数， Lk0 =碱基对数碱基对数/10.5(每圈碱基对数每圈碱基对数)，， Lk 为实际连为实际连系数Øσ值也称超螺旋密度，用于比较不同长度值也称超螺旋密度，用于比较不同长度DNA分子的超螺旋程度分子的超螺旋程度Ø拓扑异构体拓扑异构体负超螺旋与正超螺旋负超螺旋与正超螺旋Ø负超螺旋负超螺旋：由螺旋不足（：由螺旋不足（ Lk < Lk0 ，， σ<0 ）诱导的）诱导的DNA 超螺旋称负超螺旋超螺旋称负超螺旋 大部分细胞细胞DNA呈负超螺旋（右手呈负超螺旋（右手螺旋）Ø正超螺旋正超螺旋：：DNA过分螺旋时过分螺旋时（（ Lk > Lk0 ，， σ>0 ）所导）所导致的超螺旋称正超螺旋（左致的超螺旋称正超螺旋（左手螺旋）。

手螺旋） 螺旋数与超螺旋数螺旋数与超螺旋数 Ø螺旋数螺旋数（（twist ,T））: 可近似地看成可近似地看成DNA双链的双链的 相互缠绕数螺旋扭转数（相互缠绕数螺旋扭转数（number of heli calturn））Ø超螺旋数超螺旋数 （（writhe ,W）：可近似地看成是螺旋轴）：可近似地看成是螺旋轴 的缠绕数的缠绕数Ø连系数、螺旋数、超螺旋数连系数、螺旋数、超螺旋数 三者的关系可用下式三者的关系可用下式 表示：表示：L = T + W ØT与与W值可以是小数，但值可以是小数，但L值必须是整数值必须是整数L值相同的值相同的DNA之间可以不经链的断裂而之间可以不经链的断裂而相互转变相互转变Ø T与与W两项值不具有拓扑学性质，因为它两项值不具有拓扑学性质，因为它们在一个闭合环形们在一个闭合环形DNA分子的变形中可以分子的变形中可以改变2. DNA超螺旋结构的形成（超螺旋结构的形成（DNA拓扑拓扑异构酶）异构酶） DNA拓扑异构酶：拓扑异构酶：在每个细胞内含有一些专门在每个细胞内含有一些专门使使DNA超螺旋或松弛超螺旋或松弛DNA超螺旋的酶类，这些超螺旋的酶类，这些增加或减少增加或减少DNA超螺旋程度的酶，或者说能改超螺旋程度的酶，或者说能改变变DNA分子拓扑连系数的酶叫做分子拓扑连系数的酶叫做DNA拓扑异构拓扑异构酶。

酶DNA拓扑异构酶主要分两大类，拓扑异构酶主要分两大类，I 型和型和II 型ØI型酶：型酶：临时性地切开双链临时性地切开双链DNA中的一条链，中的一条链，使切口的一端围绕未切割链旋转一圈，并重新使切口的一端围绕未切割链旋转一圈，并重新连接切口这类连接切口这类DNA拓扑酶每次作用改变拓扑酶每次作用改变DNA分子的拓扑连系数为分子的拓扑连系数为1ØII型酶：型酶：二型二型DNA拓扑异构酶同时切开拓扑异构酶同时切开DNA的的两条链，一次作用改变两条链，一次作用改变DNA分子的拓扑连系数分子的拓扑连系数为为2拓扑异构酶拓扑异构酶I的作用的作用拓扑异构酶拓扑异构酶II的作用的作用琼脂糖凝胶电泳分离环形琼脂糖凝胶电泳分离环形DNA分子拓扑异构体分子拓扑异构体-+二、二、DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装1. 核小体是染色质的基本结构核小体是染色质的基本结构真真核核生生物物染染色色体体由由DNA和和蛋蛋白白质质构构成成，，其其基本单位是基本单位是 核小体核小体(nucleosome)核小体的组成核小体的组成: DNA：约：约200bp 组蛋白：组蛋白：H1，， H2A，，H2B，，H3，，H4 目目 录录H1核心颗粒：核心颗粒：DNA: 146bp 组蛋白：组蛋白：2x( H2A,H2B,H3,H4) 连接部：连接部：DNA 54bp, 组蛋白组蛋白H1串珠状核小体电子显微镜图串珠状核小体电子显微镜图 组蛋白是小的碱性蛋白组蛋白是小的碱性蛋白2. 核小体包装的高级形式核小体包装的高级形式30nm核小体纤维是核小体纤维是核小体的高级组装核小体的高级组装双螺旋双螺旋DNA染色质形式：染色质形式：核小体链核小体链螺线管：螺线管：(每圈每圈6个核小个核小体体)，， 30 nm 核小体纤维核小体纤维突环：突环：与核骨架相连。

与核骨架相连玫瑰花结：玫瑰花结：（（18环环 ，， 30梅花结为一个螺旋圈梅花结为一个螺旋圈 ））染色体：染色体： 每个染色单体每个染色单体含含10个螺旋圈个螺旋圈 真核细胞染色体真核细胞染色体DNA包装好象是一次缠包装好象是一次缠绕再接一次更高级的缠绕再接一次更高级的缠绕（超螺旋的超螺旋）绕（超螺旋的超螺旋）。