病毒接种收获尿囊液操作步骤.doc

病毒接种1. 选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象的鸡胚2. 标记注射点：接着用记号笔在气室上方约1mm处画线，的下方挑选 注射点，在挑选注射点时应注意避开主血管，避开鸡头3.打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒，用打孔器在气室线上方打孔注意：孔不宜过大，否则会导致封蜡不完全，甚至将蜡油流进鸡胚内部 4.注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液，注射时针头朝向注射点方向，每次注射停留4~6s5.封蜡：注射完毕，用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡6.培养：将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养孵化箱温度设置33~35℃，湿度50%~70%，甲型流感病毒培养48~52小时，乙型流感病毒培养66~72小时需准备的仪器试剂：手电筒，记号笔，碘酊，棉签，量筒（稀释），酒精灯，废液瓶，打孔器，三脚架，蜡块，连续注射器，一次性注射器，移液枪，移液枪枪头，镊子，纱布，打火机，蓝盖瓶 注意事项：（1）、前一天将病毒原液拿至4℃冷库；（2）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌；收获尿囊液1. 鸡胚消毒: 将培养好的鸡胚放入4℃冷库进行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1~2分钟。

接着，在鸡胚的气室用碘酊消毒2. 烙蛋：将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋3. 收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头，同时用5ml移液枪吸取尿囊液收获的尿囊液应是澄清、微黄状4. 保存：将收获的尿囊液放至6℃冷库保存需准备的仪器试剂： 新洁而灭溶液，碘酊，棉签，烙蛋器，废液瓶，镊子，5ml移液枪，5ml移液枪枪头，蓝盖瓶（数量由病毒原液体积决定）注意事项：（1）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（2）、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌；血凝滴度试验1. 稀释病毒液：取一块洁净的“96”孔血凝板，横向摆放用微量移液器（20—200ul）加入磷酸盐缓冲液100ul至第一孔，横向从第二孔开始，每孔均用微量移液器（5—50ul）加入磷酸盐缓冲液25ul直至第十二孔2. 倍比稀释：在“U”型96孔血凝板的左侧标记样品名称，用微量移液器（5—50ul）从第一孔内加入25ul病毒悬浮液吹打混匀，将病毒液稀释五倍取出25ul放到第二孔中，从第二孔开始倍比稀释，每孔吹打混匀，稀释到最后一孔弃掉25ul，此时的稀释倍数为1:10240。

3. 阴性对照：在同一块“U”型96孔血凝板的最后一排，后三孔用25ul的磷酸盐缓冲液替代供试品，作为阴性对照4. 加鸡血：将1%鸡红细胞悬液倒入加样槽吹打混匀，开始从第十二列至第一列每孔均用微量移液器（5-50μl）加入25μl的 1%鸡红细胞悬液，振荡均匀后置室温40分钟后观察结果5.结果计算：观察阴性对照，若红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，可见红细胞滑动呈泪滴状为“－”，则阴性对照成立按照《流感病毒血凝滴度检测标准操作规程》观察每孔凝集状态，结果以“++”（++以数字2代之）为终点，以红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为“++”亦即一个凝集单位，也就是说最高稀释度病毒能引起“++”号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度简称血凝滴度影响血凝抑制实验的因素1 .红细胞悬液浓度：来源于不同个体鸡的红细胞，对抗原的敏感性不尽相同因此实验时最好用3-4只未免疫鸡配制红细胞时，红细胞浓度低，HI滴度就会下降；红细胞浓度高，HI滴度就会上升有实验表明，红细胞浓度增加一倍，HI滴度就会上升20.7-0.9，因此，红细胞浓度以1％为宜 2 .抗原的稀释倍数：配制抗原时，浓度必须准确。

当抗原浓度高时，(HI)抗体效价就下降；当抗原浓度抵时，(HI)抗体效价就上升 3 .实 验 用 的 稀 释 液（PBS）： 稀释液的pH值对实验有影响稀释液的pH值5.8以下，红细胞容易产生自凝现象；pH值在7.8以上凝集图形易消失，也会造成实验误差而pH值为7.0时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HI效价也最高，因此实验时用ph7.0-7.2的稀释液 4 .实验时的温度： 实验时的温度，从4-37℃，随着温度上升，HA与HI滴度提高，但在37℃时，凝集的红细胞易洗脱；4℃以下红细胞易产生自凝，故操作常用18-22℃  （以上所阐述的是实验室操作过程中存在的几点因素，在实际工作中，也存在着其他诸多原因，如采样的时间、采样的数量、以及由疫苗产生的影响等) 流感病毒裂解疫苗生产工艺流程相关参数工艺流程相关参数接种注射0.2ml/枚收获收获8~10ml/枚离心澄清10000rpm，10~20min平板过滤0.45um超滤浓缩300KD蔗糖密度梯度离心30000rpm，3h（55%+30%+样品）超滤除糖300KD除菌过滤0.22um裂解裂解剂终浓度0.8%，每30min取样一次灭活甲醛终浓度0.02%，灭活2~5天超滤去除裂解剂灭活剂100KD层析纯化——过滤原液——。