发酵法制备生物活性肽的研究进展.docx

    发酵法制备生物活性肽的研究进展    范吉釴 柯义强 刘红海摘 要：生物活性肽是一类结构介于氨基酸和蛋白质之间的分子聚合物，具有多种生理功能，是当前研究的热点微生物发酵法制备生物活性肽是通过菌种在生长代谢过程中产生的蛋白酶水解底物蛋白从而制备生物活性肽的方法，其工艺简单、生产成本低、更易于产业化，应用前景广阔该文对微生物发酵法制备ACE抑制肽、抗氧化肽、抗菌肽和免疫活性肽的研究进展以及发酵肽产物的分离纯化方法进行了综述，并对微生物发酵法制备生物活性肽的研究趋势进行了展望，为今后发酵法制备生物活性肽的进一步研究提供参考关键词：生物活性肽;发酵法;抗氧化活性肽;超滤Abstract：Bioactive peptide is a molecular polymers with a structure between amino acid and protein，which has become the focus of current research because of its several physiological functions. Biologically active peptides prepared by microbial fermentation which is a method of preparing biologically active peptides by proteolytic produced by bacteria during the growth and metabolism process hydrolysis of substrate proteins has simple process，low production cost，easier industrialization，and broad application prospects. In this paper，the research progress of ACE inhibitory peptides，antioxidant peptides，antibacterial peptides，and immunoactivity peptides prepared by microbial fermentation and the methods of separation and purification of fermented peptide products are reviewed. It will provide references for the further studies on the preparation of biologically active peptides by the method of microbial fermentation.Key words：Bioactive peptide;Fermentation;Antioxidant active peptide;Ultrafiltration生物活性肽又称功能性多肽，是一种相对分子质量小于6000且具有多种生理功能的化合物[1-3]，它是一类是来源于蛋白质，由氨基酸经共价键连接而成的多功能化合物，对人体免疫和神经系统、内分泌系统、消化功能和心血管系统都有着重要的调节作用[4]，并且还具有抗氧化、调节血压、降低胆固醇、抑菌、抗肿瘤、提高免疫力、防癌等生理功能[5-7]。

生物活性肽具有极高的食用安全性，已经成为当前国际上极具发展前景的功能因子和食品界最热门的研究课题生物活性肽的制备方法主要肽的包括酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程重组法等[8]酶解法是一种常见的制备方法，特异性强，工艺比较成熟，但是成本较高;基因工程重组法表达短肽链有较大难度且效率低下，仅可以合成大分子肽;化学合成法生产成本高，残留物和副反应多，限制了其规模化生产与其他方法相比，微生物发酵法制备生物活性肽的发酵工艺简单，生产成本低，比其他方法更易于工业化本文主要通过介绍了发酵法制备生物活性肽的研究进展以及多肽产物的分离纯化方法，以期为发酵法制备生物活性肽的研究提供参考1 微生物发酵法概述发酵法是利用微生物菌种在生产代谢过程中产生的蛋白酶来水解底物蛋白制备生物活性肽的方法微生物在代谢过程中可以产生复合酶系，通过酶解释放出特定的高浓度生物活性肽，酶解效率更高;同时，还能够产生肽酶除去苦味肽，使生物活性肽产品的口感风味更好[9];在发酵过程中，微生物菌体本身在一系列的代谢作用下也能够合成和分泌小肽类物质;此外，菌体的代谢产物可以进一步修饰某些功能基团，提高其生物活性[10]目前，用于发酵法制备生物活性肽的菌种主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、曲霉菌以及乳酸菌等。

张树华等[11]利用枯草芽孢杆菌1.0892与黑曲霉3324混合菌种发酵绿豆蛋白粉制备绿豆多肽，结果表明，绿豆多肽有较强的抗氧化能力，其超氧阴离子清除率是46.57%，·OH清除率为47.26%王銮等[12]采用枯草芽孢杆菌与米曲霉混合来发酵榛仁粕制备榛仁肽，并优化混合菌的固态发酵工艺，结果表明，当混合菌种米曲霉和枯草芽孢杆菌比例为1∶1，在水分含量为60%、接种量15%、发酵温度40℃条件下发酵48h的产物对超氧阴离子自由基的清除能力达到98.75%一些微生物发酵法制备生物活性肽的菌种及其作用蛋白底物见表12 发酵法制备生物活性肽2.1 ACE抑制肽 高血压是一种严重危害人类健康的慢性疾病，目前已经成为世界性研究课题ACE抑制剂是目前临床上常用的降血压药物，大多為化学合成剂，长期服用后易引起皮疹、咳嗽、味觉功能紊乱等副作用，因此，人们越来越倾向寻找天然ACE抑制剂高丹丹等[13]采用市售腐乳和泡菜中筛选出来的微生物菌体发酵马铃薯蛋白制备ACE抑制肽，其发酵产物的水解度为7.72%，ACE抑制率为86.94%程龙等[14]从云南发酵食品中筛选和分离出具有ACE抑制活性的乳酸菌，进一步研究乳酸菌的益生特性和发酵脱脂乳过程中产物的ACE抑制率的动态变化，结果表明，Lb.plantarumYM-4-3菌株在37℃发酵脱脂乳48h产生多肽的ACE抑制率可达到81.23%。

Bao等[15]分别采用10种不同干酪乳杆菌发酵豆奶，经测定发现其发酵产物均具有一定ACE抑制活性常通[16]分离筛选出一株高效安全的枯草芽孢杆菌NCT314，发酵脱酚棉籽蛋白制备ACE抑制肽，并采用响应面法优化其发酵条件，棉籽蛋白发酵液的水解度可达到18.36%，ACE抑制率为64.86%盖梦[17]采用发酵法水解裸燕麦中的蛋白制备具有ACE抑制肽和抗氧化肽，发酵液进一步通过半制备型RP-HPLC分离纯化后得到纯度较高的ACE抑制肽，其ACE抑制活性为70.12%Wang等[18]利用纳豆菌对豆粕进行固态发酵，产物进一步经超滤、葡聚糖凝胶层析和RP-HPLC分离纯化步骤后，测得多肽的ACE抑制活性为84.1%，IC50值为0.022mg/mL刘颖等[19]采用复合菌液态发酵米糠制备ACE抑制肽，研究原料预先处理方式对发酵过程的影响，发现原料经膨化预处理后，多肽的转化率和ACE抑制率均高于淀粉预处理，多肽转化率能够达到38.86%，且ACE抑制活性为64.48%李响等[20]以大豆分离蛋白为底物，以肽含量和ACE抑制率为检测指标，采用多种微生物对其发酵进而筛选出具有高ACE抑制活性的发酵菌株，研究发现，保加利亚乳杆菌的发酵产物具有最强ACE抑制活性，测得其ACE抑制率为57.93%，肽含量为3.27mg/mL。

2.2 抗氧化活性肽 活性氧和自由基与人体衰老有关，细胞内过多活性氧和自由基的存在，会引起癌症、老年痴呆等疾病[21]抗氧化活性肽可以促进过氧化物和自由基的分解，清除体内多余的活性氧和自由基，从而保护人体免受氧化伤害杜昕等[22]采用枯草芽孢杆菌发酵牦牛血制备抗氧化肽，进一步以发酵解液的·OH清除率为主要指标优化发酵条件，最终确定底物浓度75g/L，接种量2.5%（V/V），发酵时间69.5h为最佳发酵条件，此时抗氧化肽的·OH清除率为74.48%，最终发酵液的多肽含量为2.31mg/mL夏琪娜等[23]采用微生物发酵法制备活性肽WPI和GA，研究其对微胶囊过氧化值的影响，结果表明：添加0.1%抗氧化肽，微胶囊的POV值增量与对照组相比减小，说明抗氧化肽对过氧化值影响显著（P<0.05）胡姝敏等[24]优化发酵法制备乳清蛋白抗氧化肽的发酵工艺参数，结果表明，当乳清蛋白含量为10%，接种量为3.5%，温度43.3℃，发酵时间63h为最佳发酵条件杨丽娜[25]通过自筛菌种和商业化菌种复配了2株协同作用良好的乳酸菌复合菌种，结果表明，当2种菌种复配比例为1∶1，接菌量4%，在42℃下发酵5.5h时羊乳发酵乳的感官性能最好，此时该发酵乳的·OH清除率为89.85%，DPPH清除率为85.30%，Fe2+螯合能力为20.76%，具有显著的抗氧化活性。

2.3 抗菌肽 抗菌肽一般是由2～15个氨基酸序列构成的小肽，具有良好的杀菌活性和免疫学活力，对病毒、癌症细胞有一定的杀伤作用相比于抗生素，抗菌肽在杀死肿瘤细胞的同时对机体正常细胞不产生毒性，对机体自身不产生伤害[26]，且不易使细菌产生耐药性，因而其在抗癌药物的开发方面具有很大的潜力彭建等[27]通过氨基酸替换和序列截短的方法来改造抑菌肽Cec4，发现与母肽相比，Cec4经过氨基酸替换后对各测试菌抑菌活性提升1倍，Cec4在截短后丧失抑菌活性，而且抗菌肽在1mg/mL浓度下对人体无溶血反应曹丁等[28]通过优化芽孢杆菌GL08发酵培养基的配方来提高抗菌肽的产量，在优化后的发酵培养基中，500L中试水平杀菌效价提高90%左右，为15311 IU/mL，这种发酵工艺降低了抗菌肽的生产成本，并且提高了稳定性，为其工业化生产提供了新的思路，同时为抗菌肽的商业化应用奠定了良好的理论基础张志焱等[29]通过对优化一株枯草芽孢杆菌BL0006的发酵条件和配方来提高发酵液中抗菌肽的效价，优化后效价为4.25×104U/mL，是优化前的3.51倍，能够达到高产、降低成本、缩短发酵时间的效果2.4 免疫活性肽 免疫活性肽是一类具有增强机体免疫力、促使淋巴细胞分化成熟和转移免疫信息等生理功能特性的多肽类的总称[30]，具有促进淋巴细胞的增殖、增强自噬细胞（NK）的机能、提高巨噬细胞活性、促进细胞因子生成等功能[31-32]，同时也可巩固机体防御能力和提高机体的免疫力，并且具有无毒、低过敏性、高安全性等优点，在人类营养健康和疾病预防中发挥着重要的作用[33]。

李善仁等[34]采用米曲霉和芽孢杆菌CS27发酵豆粕，发现当2种菌株的接种比例为1∶2，30℃下发酵48h时大豆肽得率和大豆肽质量分数分别为51%，23.98%Elfahri等[35]采用3种不同的瑞士乳杆菌及其粗酶提取液（CPE）在37℃条件下发酵牛奶蛋白12h，发现获得的短肽混合物均可以促使IFN-γ的含量的增加和人外周血单核细胞（PBMCs）中IL-10的分泌侯银臣等[36]用枯草芽孢杆菌对羊胎盘下脚料发酵来制备免疫活性肽，结果表明，当料液pH5.42、发酵时间为43.45h、碳源含量1.73%时，发酵产物对小鼠脾淋巴细胞的刺激效果明显;当发酵液中蛋白为100μg/mL时，小鼠脾淋巴细胞的刺激指數为23.26%，与100μg/mL LPS和50μg/mL Con A共同作用的免疫效果显著张奕[37]通过发酵驼乳制备免疫活性肽，结果表明驼乳多肽能够降低BALB/C小鼠脾淋巴细胞中IL-6和NF-κB的mRNA相对表达量，同时能够升高IFN-γ、IL-23、IL-12的mRNA相对表达量来对细胞进行免疫调节3 发酵液中多肽产物的分离纯化生物活性肽的分离纯化技术对生物活性肽序列分析、构。