原核表达.ppt

实验五实验五 原核表达原核表达1一、原理一、原理§1、、 E.coliE.coli表达系统表达系统§E.coliE.coli是重要的原核表达体系在重是重要的原核表达体系在重组基因转化入组基因转化入E.coliE.coli 菌株以后，通过菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行目的蛋白质，将表达样品进行SDS-SDS-PAGE PAGE 以检测表达蛋白质以检测表达蛋白质§本实验采用异丙基硫代本实验采用异丙基硫代-β-D--β-D-半乳糖半乳糖昔（昔（IPTGIPTG）诱导外源基因表达）诱导外源基因表达22.SDS-2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）） 使使用用含含有有十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（（ SDSSDS））和和还还原原剂剂（（通通常常为为巯巯基基乙乙醇醇））的的样样品品处处理理液液对对蛋蛋白白质质样样品品进进行行处处理理（（一一般般煮煮沸沸3-53-5分分钟钟）），，通通过过加加热热和和SDSSDS可可以以使使蛋蛋白白质质变变性性，，多多亚亚基基的的蛋蛋白白质质也也将解离为单亚基。

将解离为单亚基3§SDSSDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用巯基乙醇打开二硫键，因键和疏水作用巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态此使蛋白质分子处于伸展状态聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点结构上的特点 4 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素净电荷以及分子大小和形状等因素加入加入SDSSDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的的分子量，而与原来所带电荷、分子形状分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关5电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子67二、试剂二、试剂§LB培养基培养基 §SOC培养液培养液 §50 μg/mL Amp§IPTG §SDS-PAGE Loading Buffer 89SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂§30%丙烯酰胺凝胶贮液丙烯酰胺凝胶贮液： 丙烯酰胺30 g， N, N-亚甲双丙烯酰胺 0.8 g§4×Tris·Cl/SDS pH 8.8：18.2 g Tris碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为8.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS。

§4×Tris·Cl/SDS pH 6.8：6.05 g Tris碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为6.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS10§样品缓冲液：样品缓冲液：1 mL 4×Tris·Cl/SDS(pH 6.8)，，1 g SDS，，2 mL β-巯基乙醇，巯基乙醇，1 mL 0.1%溴酚兰，溴酚兰，5 mL 甘油，加蒸馏水定容甘油，加蒸馏水定容到到50 mL§电极缓冲液：电极缓冲液：0.6 g Tris碱，碱，2.88 g甘氨酸，甘氨酸，0.1 g SDS§固定液固定液：：50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸§染色液：染色液：0.05%(w/v)考马斯亮蓝考马斯亮蓝R-250，，50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸§脱色液：脱色液：7%冰醋酸，冰醋酸，5%甲醇甲醇11 三、设备三、设备1213四、步骤四、步骤§1. E. coli BL21 (DE3) 感受态的制备感受态的制备§2. 重组子转化重组子转化BL21§1）在预冷的）在预冷的EP管中加入管中加入1 μL质粒质粒DNA，加入，加入200 μL BL21 (DE3)感受态细胞，混匀后在冰浴感受态细胞，混匀后在冰浴上静置上静置30 min。

§2）） 42℃℃水浴热冲击水浴热冲击30 s，冰浴上放置，冰浴上放置10 min，，加入加入0.8 mL SOC培养液置于培养液置于37 ℃℃振荡培养振荡培养1 h§3）） 取取0.1 mL涂布于加有抗生素的涂布于加有抗生素的LB培养基平板培养基平板（（50 μg/mL Amp）上，）上，37 ℃℃培养过夜培养过夜 143.3.原核表达原核表达§1)挑取上述方法得到的单菌落于挑取上述方法得到的单菌落于2 mL LB液体培养基液体培养基(氨苄青霉素氨苄青霉素50 μg/mL)中同时，时，BL21作为对照（不加抗生素）于作为对照（不加抗生素）于37℃℃培养至培养至OD600为为 0.5. §2)取取20 μL菌液接种菌液接种2 mL LB液体培养基液体培养基(氨氨苄青霉素苄青霉素50 μg/mL), 37℃℃培养培养OD600为为 0.5，，§3)加入加入IPTG最终浓度梯度最终浓度梯度2mM ，，18℃℃诱导诱导表达表达16h15§4)诱导结束后，用超声波破碎细胞诱导结束后，用超声波破碎细胞§5））1mL菌液加入菌液加入100μL的的SDS-PAGE Loading Buffer，，100℃℃煮沸煮沸5min。

§6）取）取30μL上清样品点样，分析上清样品点样，分析SDS-PAGE胶，观察表达结果胶，观察表达结果164.SDS-PAGE§1) 1) 按下表配方制备按下表配方制备SDS-PAGESDS-PAGE凝胶，凝胶，加样先10 mA10 mA恒流电泳至分离胶，恒流电泳至分离胶，再调为再调为15 mA15 mA恒流到电泳结束恒流到电泳结束17SDS-PAGESDS-PAGE胶配方胶配方组分组分 12%分离胶分离胶(mL) 3.9%浓缩胶浓缩胶(mL) 丙烯酰胺贮液丙烯酰胺贮液 60.654×Tris·Cl/SDS, pH 8.83.754×Tris·Cl/SDS, pH 6.8 1.25ddH2O5.253.0510%过硫酸铵过硫酸铵 0.050.025TEMED 0.010.00518§2) 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色§（（1）：将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定）：将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2 h；；§（（2）倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染）倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染色色4 h§(3)倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色中间换脱色液，脱色到获得蓝色条带色。

中间换脱色液，脱色到获得蓝色条带及干净的背景为宜及干净的背景为宜19若有不当之处，请指正，谢谢！20。