黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案.docx

精品黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案一、黄曲霉毒素介绍黄曲霉毒素（aflatoxin,简称为AF）是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中黄曲霉毒素比较耐热，加热至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除二、黄曲霉毒素对人体的危害1 、引起急、慢性中毒：黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件，国内外均有许多报导，最典型的是印度的霉变玉米事件，该事件直接导致了数十人丧生，数百人患上不同类型的肝脏疾病2 、致癌性：黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒，50~100ug/kg时为中毒，100~1000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。

鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg（即5ppb）三、黄曲霉毒素的种类黄曲霉毒素主要有4种：即Bi、B2、Gi、G2,其中Bi被认为是主要的有毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素Mi是动物摄入黄曲霉毒素Bi后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见黄曲霉毒素Mi的毒性和致癌性与黄曲霉毒素Bi的基本相似由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大四、最新政策及国标（含国外一些政策）1 、自2003年8月i日起，凡在我国境内从事米、面、油、酱油、醋生产加工的企业，其产品须经检验合格后方可上市国家质检总局发布的《关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知》中明确规定，黄曲霉毒素Bi必须检测2 、在第八期《中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报》中发布关于黄曲霉毒素检测方法的最新国标：（i）、GB/Ti8979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定——免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》（2）、GB/Ti8980-2003《乳和乳粉中黄曲霉毒素Mi的测定——免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》以上两项国标均在2003年8月i日开始实施3、2002年2月4日欧盟决议对从中国进口或委托从中国进口的花生和花生制品实施黄曲霉毒素强制性检测的特殊条件五、中国及国际上对黄曲霉毒素的检测标准1、主要国家:品名中国标准美国标准欧盟玉米、花生、花生油，坚果和干果（核桃、杏仁）<20闯/kg(ppb)w20dg/kg(ppb)W2、4、5、8、10、15闻/kg(ppb)玉米及花生仁制品（按原料折算）<20闯/kg(ppb)w20dg/kg(ppb)W2、4、5、8、10、15闻/kg(ppb)大米、其它食用油（香油、菜子油、大豆油、癸花油、胡麻油、茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油）<10闯/kg(ppb)w10科g/kg(ppb)<2、4闻/kg(ppb)其它粮食（麦类、面粉、薯十）、发酵食品（酱油、食用醋、豆豉、腐乳制品）、淀粉类制品（糕点、饼干、面包、裱花蛋糕）<5间/kg(ppb)<5间/kg(ppb)不得检出牛乳及其制品（消毒牛孚L、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油）、黄油、新鲜猪组织（肝、肾、血、瘦肉）4.5四/kg(ppb)v0.5科g/kg(ppb)<0.05闯/kg(ppb)2、其他(1)、WHO/FAO标准。

国际卫生组织(WHO)/世界粮农组织所属的食品法典委员会(CAC)推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量(B1+B2+G1+G2)小于15@kg;牛奶中Mi的最大允许量为0.5闻/kg(2)、南非标准1990颁布了黄曲霉毒素的最大允许标准：食品中黄曲霉毒素总量小于10闺/kg,其中黄曲霉毒素Bi小于5akg3)、其他标准印度标准是花生中黄曲霉毒素Bi小于30闻/kg;越南和阿根廷的标准为黄曲霉毒素Bi小于20(jg/kg六、黄曲霉毒素检测方法测定黄曲霉毒素测定的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法这些方法中，国标方法“免疫亲和柱法”是现在国际公认的比较经济有效的分析方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被列为标准方法，如：美国公职分析化学家协会(AOAC)美国农业部联邦谷物检测中心(FGIS)国际纯粹与应用化学协会(IUPAC)美国食品药品行政署(US-FDA)美国农业部(USDA)同时在国内被认证的机构：中国出入境检验检疫局(CIQ)七、黄曲霉毒素检测—“免疫亲和柱法”方法有以下特点：1 、认证机构广泛，通用性强2 、分析速度快，一个样品只需10-15分钟，其他传统的方法要做到定量分析需要几小时至几天的时间。

3 、灵敏度高，测定范围广泛（0-300ppb）,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素四种异构体，用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素B1o4 、采用单克隆免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强八、黄曲霉毒素检测—“免疫亲和柱法”方法具体步骤如下：1、试剂配制（1）样品提取溶剂：甲醇/水（4/1，v/v）（ 2） 5mmol磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH7.2）母液配制：1）称取50.14gNa2HPO4.12H2O溶解于700ml水中2）称取9.66gNaH2PO4.H2O溶解于350ml水中3）将上述两种溶液进行混合并加入42.5gNaCl，配制成pH7.25mmol磷酸盐缓冲溶液（ 3） 1mmol磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH7.2）工作液配制：取200ml的5mmol磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）稀释于800ml水感谢下载载精品（4）磷酸盐缓冲溶液（PBS）/吐温（Tween）配制：取8ml吐温-20稀释于92mlpH7.2磷酸盐缓冲溶液中（5）HPLC流动相配制：水/甲醇/乙腈（60/30/15,v/v）2、样品处理方法：方法一：标准方法该处理程序适用于样品基质中没有干扰，主要适用于大多数谷类样品的处理。

1、取20g样品加入100ml提取液（甲醇/水，4/1，v/v）放入匀浆机中，并高速搅拌5分钟2、用滤纸过滤上述提取液3、取14ml过滤后的提取液加入86ml的1mmolPBS缓冲溶液（pH7.2）如果样品量比较少，取样品体积可以适当减少（如1.4ml+8.6ml缓冲溶液）如混合过程中有沉淀产生，样品需要用注射过滤器进行过滤或进行离心4、打开净化柱上密封盖和下面堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处5、取5-50ml稀释后的提取液（取样体积根据分析方法的灵敏度来确定）上AflaCLEANTM柱在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压；但必须保证过柱流速不大于1-2滴/秒尽量让所有上样样品都通过柱子流出来，即使柱中溶剂流干了也没有太大问题，但是要避免柱子溶剂完全流干6、用10ml蒸馏水或纯化水清洗柱子7、用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水8、每次用1ml甲醇洗脱柱子，可洗2次第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子9、根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行HPLC分析方法二：标准方法加正己烷分层该样品处理方法针对样品中含有油脂比较多，如坚果类，一些香料或无花果酱，脂肪和样品中含有一些需要用正己烷去除的杂质。

1 、称取20g样品并加入2g的氯化钠2 、加入100ml提取溶剂（甲醇/水，4/1，v/v）和50ml正己烷于匀浆机中高速搅拌5min3 、静止分层，取下层液进行下一步处理4 、取下层液用滤纸过滤5 、取14ml过滤后的提取液加入86ml的1mmolPBS缓冲溶液（pH7.2）如果样品量比较少，取样品体积可以适当减少（如1.4ml+8.6ml缓冲溶液）如混合过程中有沉淀产生，上柱液需要用注射过滤器进行过滤或进行离心6 、打开净化柱上端密封盖和下端堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处7 、取5-50ml稀释后的提取液（取样体积根据分析方法的灵敏度来确定）上AflaCLEANTM柱在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压；但必须保证过柱流速不大于1-2滴/秒尽量让所有上样样品都通过柱子流出来，即使柱中溶剂流干了也没有太大问题，但是要避免柱子完全溶剂流干8 、用10ml蒸馏水或纯化水清洗柱子9 、用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水10 、每次用1ml甲醇洗脱柱子，可洗2次第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子下端，使甲醇在净化柱中保持5min后，再放出收集11 、根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行HPLC分析。

方法三：标准方法加正己烷分层和PBS/Tween稀释该处理过程用于样品含有干扰杂质，主要是大部分的香料和中草药1 、此处理过程样品最大取样量为20g（一些样品需要减少取样量可以达到比较好的提取效果）2 、称取20g样品并加入2g氯化钠3 、样品先进行均质化处理，向处理好的样品中加入100ml提取溶剂（甲醇/水，4/1，v/v）和50ml正己烷于匀浆机中并高速搅拌5min4 、提取液静止分层，取下层溶液进行下一步处理5 、取下层溶液用滤纸过滤6 、取5ml滤液加入35mlPBS/Tween溶液稀释如稀释混匀中出现沉淀，需用注射过滤器进行过滤或离心7 、打开净化柱上端密封盖和下端堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处8 、取14ml稀释后的提取液（取样体积根据分析方法的灵敏度来确定）上AflaCLEANTM柱在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压；但必须保证过柱流速不大于2ml/min尽量让所有上样样品都通过柱子流出来，即使柱中溶剂流干了也没有太大问题，但是要避免柱子完全溶剂流干9 、用10ml蒸馏水或纯化水清洗柱子10 、用气体吹扫或抽真空除去柱子中的残余的水11 、每次用1ml甲醇洗脱柱子，可洗2次。

第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子下端，使甲醇在净化柱中保持5min后，再放出收集12 、根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行HPLC分析3、HPLC分析方法：黄曲霉毒素检测需要一台配有荧光检测器的HPLC系统黄曲霉毒素HPLC分析检测条件可参照以下设定：流动相：水/甲醇/乙腈60/30/15（v/v）；流速：1.2ml/min进样量：10-100山；柱温：36cHPLC黄曲霉毒素专用分析柱：150M.6mm;RPC18（货号：10522）荧光检测器设置：EX.:365nm;Em.:460nm。