DNA蛋白质的相互作用实用教案.ppt

引言(yǐnyán)1.很多细胞的生命活动涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白(dànbái)质结合因子之间的相互作用：DNA的复制和重组；mRNA的转录和修饰；病毒的感染与增殖等2.随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究显得尤为重要而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域而要深入研究基因表达调控的分子机制必须要研究DNA与蛋白(dànbái)质的相互作用3.在重组DNA技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要生物学意义的基因在这种情况下科学工作者开始把自己的研究兴趣逐渐转向DNA结合蛋白(dànbái)这一课题上 第1页/共27页第一页，共28页•凝胶阻滞试验(shìyàn)•DNaseI足迹试验(shìyàn)•甲基化干扰试验(shìyàn)•体内足迹试验(shìyàn)•酵母单杂交技术•染色质免疫沉淀技术•噬菌体展示技术•核酸适体技术•生物信息学方法•蛋白质芯片技术及纳米技术￿第2页/共27页第二页，共28页一、凝胶阻滞一、凝胶阻滞(zǔ￿zhì)试验试验（（DNA迁移率变动试验迁移率变动试验DNA￿mobility￿shift￿assay））1 原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其(yǔqí)分子量的对数成反比。

如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了 第3页/共27页第三页，共28页2 主要步骤及内容(nèiróng)： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA）同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置 不存在(cúnzài)与DNA结合的蛋白质时存在(cúnzài)与DNA结合的蛋白质时第4页/共27页第四页，共28页￿￿￿￿凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异(tèyì)的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异(tèyì)性￿超量的非标记(biāojì)的竞争DNA (competitor DNA ）第5页/共27页第五页，共28页第6页/共27页第六页，共28页材料及试剂：2X结合缓冲液：20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、 poly(dI-dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-标记探针缓冲液C：20 mM、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、0.5 mM 二硫苏糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA4%天然的聚丙烯酰胺凝胶(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷，41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（过硫酸铵）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴烷电泳缓冲夜。

填充染料：0.2% 溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50% 甘油操作步骤：1.配置(pèizhì)反应混合液：探针DNA (1 ng、dH20 6.3 ml、2x 结合缓冲液 12.5 ml、BSA (10 mg/ml) 1.0 ml 、poly(dI-dC、2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5 ml3.加10~15 mg上述溶液（£ 5 ml)到反应混合物中，总体积应不大于25 ml4.在室温下培养20min5.加入2.5 ml的填充染料6.装载样品到4%的聚丙烯酰胺凝胶柱中7.室温下跑电泳，至溴酚蓝距底部1cm处停止8.80℃下干燥凝胶，进行放射自显影处理 第7页/共27页第七页，共28页二、二、DNaseI足迹足迹(zújì)试验试验(DNaseI￿footprinting￿assay)￿DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术 首先是单链标记，然后用DNaseI水解(shuǐjiě)单链标记的双链DNA，产生“DNaseI保护”，尿素变性，PAGE分离及放射性显影，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相应于DNA结合蛋白的位置上由于DNA结合蛋白的保护作用而形成了空白区域。

第8页/共27页第八页，共28页如果在电泳时结合(jiéhé)DNA化学测序，则可准确判断出结合(jiéhé)区的精确序列第9页/共27页第九页，共28页三、甲基化干扰三、甲基化干扰(gānrǎo)试验试验根据DMS （二甲基亚蓝）能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割(qiēgē)甲基化的G残基这一原理而设计 先用DMS处理DNA；（并控制反应条件，使之达到平均每条DNA分子只有一个(yī ɡè)残基被甲基化）将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当细胞提取物一道温育；并做凝胶阻滞试验经电泳分离后，从凝胶中切除具有结合蛋白的DNA条带和没有结合蛋白的DNA条带，并用六氢吡啶处理之 第10页/共27页第十页，共28页￿￿￿￿检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间的相互作用模式￿￿￿￿DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能使T和C甲基化￿￿￿￿故本实验(shíyàn)为足迹实验(shíyàn)的补充手段第11页/共27页第十一页，共28页四、酵母单杂交四、酵母单杂交(zájiāo)技术技术￿ 真核生物中 ，转录因子中DNA 结合结构域(DNA-binding domain BD)与转录激活结构域( activationdomain AD) 能够相互独立发生作用。

酵母中的转录因子GAL4 的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的(mùdì)基因相互作用同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶启动下游报告基因的转录 第12页/共27页第十二页，共28页•设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中;￿•将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活(jī￿huó)域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中;•若文库蛋白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来.￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿注：这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA￿片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白.￿酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用的研究第13页/共27页第十三页，共28页不足以充分反映生理条件下，DNA与蛋白质相互作用的真实情况因为，高等生物的基因组有染色质结构，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA与蛋白质，在生理状态下，这段DNA很可能并不与其相对应的因子相结合另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状态下的相互作用通常是瞬时的，以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达(biǎodá)调控的瞬时事件 以上(yǐshàng)技术都有一定的局限性第14页/共27页第十四页，共28页。

八、染色体免疫沉淀技术八、染色体免疫沉淀技术(jìshù)Chromatin￿immunoprecipitation￿（（ChIp））1.技术介绍在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体只有与目的蛋白结合的DNA片段(piàn duàn)才能够被沉淀下来 第15页/共27页第十五页，共28页2、主要(zhǔyào)步骤及内容•细胞的甲醛固定•超声波断裂染色质•氯化铯等密度离心纯化交联的染色质￿•染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化￿•交联反应的逆转和DNA的纯化•染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定(jiàndìng)•目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证￿￿￿第16页/共27页第十六页，共28页1.细胞的甲醛固定 在1%甲醛的作用下，DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的氨基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的DNA和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成(xíngchéng)生物复合体，防止细胞内组分的重新分布加入甘氨酸来终止交联反应。

第17页/共27页第十七页，共28页2.超声波断裂染色质 甲醛交联后的染色质对限制酶和DnaseI高度抵抗，因此通常使用超声波使得染色质断裂打断后的染色质片段的平均长度(chángdù)应该在500-1000bp左右可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）第18页/共27页第十八页，共28页3.氯化铯等密度离心纯化交联的染色质 氯化铯等密度离心可以除去未交联的蛋白质、DNA和RNA样品中加入0.5%的十二烷基(wán jī)肌氨酸钠，通常在4000rpm离心72h离心后，用连接到蠕动泵的毛细管从梯度的底部分步收集染色质组分，在4℃透析过夜 第19页/共27页第十九页，共28页4.染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化 用目的蛋白特异性的抗体进行染色质免疫沉淀抗体的量要进行优化防止非特异的结合用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体经过洗涤(xǐdí)除去非特异结合的染色质后，用1%SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合体 第20页/共27页第二十页，共28页5.交联反应(fǎnyìng)的逆转和DNA的纯化在免疫沉淀复合体中加入不含Dnase的Rnase，proteinase K。

65℃保温6h使交联逆转经酚氯仿抽提-乙醇沉淀纯化DNA纯化的DNA极少，可用色谱定量第21页/共27页第二十一页，共28页6.染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定 染色质免疫沉淀的DNA的分析方法有许多种如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑(huáiyí)某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和PCR分析;如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况,找出反式作用因子的结合位点,可以采用Southern杂交、ChIP克隆和DNA芯片方法 第22页/共27页第二十二页，共28页7.目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证 染色质免疫沉淀分析得到的结果有很大一部分是假阳性，需要(xūyào)采用其他方法验证结果的真实性用PCR方法进行独立的ChIP分析、电泳迁移率变动分析、酵母单杂交系统及荧光素酶报告系统最终确定目的蛋白与靶DNA序列的特异性结合 第23页/共27页第二十三页，共28页近年来发展起来的基因芯片（chip）染色质免疫沉淀ChIP技术相结合(chip-ChIP)的方法要一个PCR步骤来扩增染色质免疫沉淀富集的DNA。

特异性染色质免疫沉淀的DNA和对照DNA的PCR产物分别用Cy5和Cy3荧光光标记，用于与含有整个基因组的DNA芯片进行杂交 通过比较两种荧光信号的强度筛选出目的蛋白可能(kěnéng)的结合序列在基因组的水平上绘制出目的蛋白的分布图谱 chip-ChIP法大大促进了在基因组水平上高通量对DNA和蛋白质的相互作用的研究 第24页/共27页第二十四页，共28页前景与展望：进一步研究DNA~蛋白质的相互作用需要生物学、化学、医学、物理学、计算机学及电子学等多学科的协作 随着各种新技术在这个研究领域的应用，人类一定能在不远的将来(jiānglái)揭开蛋白质与核酸相互作用的规律 第25页/共27页第二十五页，共28页谢谢(xiè xie)！第26页/共27页第二十六页，共28页感谢您的观看(guānkàn)！第27页/共27页第二十七页，共28页内容(nèiróng)总结引言1.很多细胞的生命活动涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中以上方法难以(nányǐ)捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件。

打断后的染色质片段的平均长度应该在500-1000bp左右用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体通过比较两种荧光信号的强度筛选出目的蛋白可能的结合序列第二十八页，共28页。