富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究.doc

富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究作者：李岩，李明陈伟强，邙枣园，黄宁【摘要】 目的构建富组蛋白5(histidine rich protein 5, HRP 5)重组表达载体，表达并纯化HKI) 5蛋白，观察其抗菌作用方法用基因克隆的方 法构建PET 32a HRP 5重组表达质粒，经IPTG诱导表达后，用亲和层析的方法纯化HW 5融合蛋片，THcine SDS PAGK屯泳鉴定其分子量，琼脂糖弥散法检测其抗菌功能结果成功构建了 pKT 32a HRP 5表达质粒并表达、 纯化111HKP 5融合蛋白，融合蛋白对致病性人肠杆菌54299和绿脓杆菌PA01有抗菌活性结论I1RP 5是一种抗菌分子，参与了机体的天然免疫防御功能关键词】富组蛋白5；蛋白表达；亲合层析;抗菌活性Abstract：Objective To express grid purify recombinant HRP 5 protein and investigate its antimicrobial activity. Methods The recombinant prokaryotic expres. s i ng pi asm i d. pRT 32a IIRP 5 was constructed bygene cloning. Induced by IPTG, the fused protein with thehistdinc tagged was purified by HisTrap Kit and identified by Tricine SDS PAGK. The antimicrobial activity of HRP 5 was detected by agarose diffusion assay. Results The recombinant HRP 5 protoin was purified by affinity chromatography and showed antibacteridl effective activities against the pgthogenic strains of Escherichia coli 54299 and Pseudomonas aeruginosa PAOi. Conclusion HRP 5 protein is a potent antimicrobial molecule and it is involved in the defense of the innate immunity in vivo.Key words*h isLidi ne rich prolein 5； prolei n express!on ； aV f i n i tychromatography； antimicrobial activity富组蛋A(hisLidine rich proleins, IIRPs) %一组分子量为 3〜5 kD、分子中富含组氨酸的阳离子多肽，主耍由灵长类动物腮腺和颂下腺分泌。

1984 年研究者首次报道了 HRPs对变形链球菌、白色念珠菌有抑制生长和杀菌作用[1, 2],随后的研究显示HRPs作为一组内源性抗菌肽，参与宿主非特异性免疫 防御系统，与多种口腔感染性疾病密切相关在至少由12种蛋白组成的HRPs 家族中,HRP1、3、5作为主要富组蛋白,其蛋白质之和占HRPs总含量的85%以 上1IKP ,5是HKP 3的蛋白裂解产物，由IIKP 3 N末端的24个氨基酸残基纽成，是HRPs家族中抗菌效果最强的蛋片[3, 4]木实验利用基因克隆的方法构建了 PET 32a HRP 5重组表达质粒，经IPTG诱导厉，用亲和层析的方法 获得纯化的HRP5融合蛋白，并川琼脂糖弥散法抗菌实验证实重组蛋白的抗菌功 能琼脂糖、溶菌酶、胰蛋白豚、酵母提取物、人豆培养基、过硫酸钱、Tris、 Tricine （Sigma公司）；丙稀酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、蛋片质Marker （Merck公司）；考马斯亮蓝R250（上海试剂厂进口分装产品）；连接试剂盒、限制性内切酶、TaqB（Fcrmcntas公司）；质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒（Omega 公司）;IPTG （华美公司）；引物、Trizol试剂、DEPC及两步法RT PCK试剂盒 （Takara公司）；HisTrap Kit（Amersham公司）；致病性大肠杆菌54299、绿脓杆菌PAO1.宿主菌DE3及原核表达质粒pET 32a均为本室保存。

1. 2主耍仪器纯水仪（M订lipore公司）；超净工作台（苏净集团）；PCR仪（Biometra公司）；凝胶成相仪（Amersham公司）；低压色谱仪（Amersham公司）2方法2. 1 IIRP 5分子片段的制备腮腺组织來源T人因腮腺纤维瘤切除腮腺的止常腮腺组织部分，按说明书 用Trizol法提取总RNA为模板，以Oligo d （T） 18为引物逆转录合成第一链cDNAo根据Gene Bank（登陆号:BC009791, HRP ：5）设计特异性引物,上游引 物 P1： 5' CCG （； （；A TCC GAT TCA CAT GCA AA（ ; AGA CA 3’，含 Bam 11 I 酶切位点，下游引物 P2： 5' CT（ ; GAG CrC ATC GCC TCG AT（; T（;A AT（; 3’ □含Sal I酚切位点，扩增HKP 3 N末端的24个氨基酸编码序列PCR反应条件 为：95 ° C 预变性 2 min, 94 ° C 变性 30 s, 53 ° C 退火 30 s, 72 ° C 延伸 45s,进行30个循环，最后在72 j延伸10 mino PCR反应结束后，取5 |j L琼 脂糖凝胶电泳鉴定，并进行纯化。

2. 2 11RP 5分子的连接转化纯化的扩增产物用加m H I和Sal I双酶切，然厉按常规方法连接于同样 双酶切的原核表达质粒pF/T 32a载体将连接产物转化入人肠杆菌DE3,挑取阳性菌落送Takara公司进行基因测序鉴定2.3重组融合IIW 5蛋白的分离纯化和鉴定IPTG诱导人肠杆菌DE3的蛋白表达，-70 "37 ° 0反复冻融10次后，用超声破碎仪破菌，收集上清，经HisTrap Kit柱亲合层析法纯化，Tricine SDS PAGE 鉴定2. 4重组融介IIRP 5蛋白的抗菌作川采用琼脂糖弥散法进行抗菌功能研究，主要步骤：制备底层含菌培养基 （0. 3%人豆，1%琼脂糖，10 mmol/L, pH 5. 5的柠檬酸磷酸氢二钠，加入对数 生长期细菌3X105 /mL）,旋涡震荡后倒入无菌平皿中，待凝固后在底层培养 基上打肓径3 mm的圆孔，每孔加入5 M L重组融合HKP 5蛋白，以溶菌酶做 阳性对照，37 ° C孵育3 h后，在底层含菌培养基上倒入顶层培养基（1%琼脂 糖，6%人豆）,37 ° C孵育过夜3结果3. 1重组表达质粒pli'l' 32a I1KP 5的鉴定以腮腺总RNA为模板，采用两步法KT PCK法，用HRP 5特异性引物扩增， 在低子100 bp处可见清晰的条带。

将PCR产物连接到pET 32s载体，用酶切 法筛选阳性质粒，结果见图1阳性质粒经进一步测序鉴定，结果与IIRP 3 N 端24个氨基酸残基编码序列一致，说明pBT 32a IIRP 5表达载体构建成功3. 2融合蛋白HKP 5的分离纯化将经IPTG诱导表达的上清用HisTrap Kit亲和层析柱纯化后行 Tricinc SDS PAGli电泳，可见在约23 kD处有明显表达增强的条带以及经过 亲和层析柱纯化厉较为单一的条带，蛋白分子量人小与预期相符，结果见图23. 3重纽蛋白抗菌作用重组蛋白HKP 5对致病性人肠杆|莉54299和绿脓杆菌PA01有明显的抗菌作用，说明通过原核表达，获得了具有抗菌活性的HKP 5蛋白，结果见图34讨论近年來，学者们对机体抗感染防御功能的认识取得了显著进展其中一个主 要的突破就是发现动物界普遍存在有很强抗菌活性的内源性抗菌肽@ ndogenous antibiotic peptides）,它是机体对抗微生物感染的关键因索［5］目前在植物、昆虫、两栖类动物、哺乳动物中已经发现了超过100多种抗菌肽分子，它们具 有较强的抗微生物活性，在维持机体的抗微生物免疫功能方面具有重要作川［6］。

在人类，不仅与免疫密切相关的中性粒细胞、巨噬细胞等细胞中有抗I莉活性分 子的存在，上皮细胞也是抗菌分子的重耍来源目前在消化系统、呼吸系统和 泌尿生殖系统等与外界相通的组织器官中都己经分离得到了多种抗菌分子，包 括乳铁蛋片、溶菌酶、防御索家族蛋ftfllCathelicidins家族蛋白等唾液蛋白质是唾液的主要组成成分，它对维护口腔止常的功能和口腔组织 健康及口腔微生物的动态平衡起着重耍作用［7］人量研究发现，HRPs对引起口 腔感染的白色念珠菌、溶血链球菌等细菌有•抑菌和杀繭作用，证实HRPs是一组 内源性抗菌肽，在口腔对抗细菌感染和口腔感染性疾病中发挥重耍作用［8, 9］ 国内吴琦［10］等也得到了类似的研究结果，并发现lIRPs对真菌、革兰阳性和阴 性细菌都有抗菌作用，还可以中和革兰阴性菌分泌的内毒索，提出HRPs是一种 广谱的抗菌分子罗海燕［11］等也证实了 HRPs对多种细菌的杀菌作用本实验利用原核表达质粒pCT 32g成功地构建、表达出融合蛋白IIKP 5,经HisTrap亲和层析柱纯化厉，用琼脂糖弥散抗菌法证实此融合蛋口对致病性 大肠杆菌54299和绿脓杆菌PA01有抗菌作丿|［。

另外，原核表达质粒pCT 32a由于存在独特的硫氧还原蛋白编码基因，能增加此融合蛋白在人肠杆菌细胞质 中的可溶性，同时由于该原核表达质粒所编码蛋白的N端与C端均带有His标 签，使融合蛋白更有利于被分离纯化，这些优点有利于体外制备人量的iim) 5分子，以进一步研究HKP 5对其他细菌的杀伤作用及其作用机制参考文献】[1] MACKAY B J, DENEP1T1YA L, IACONO V J, et al.Growth inhibitory and bactericidal offccts of human parotid salivary histidine rich polypeptides on Streptococcus mutans[J]. Infect Imrnun, 1984, 44(3)： 695-701・[2] POLLOCK J J, DENEPITIYA L, MACKAY B J, et al. Fungistatic andfungicidal activity of human parotid salivary histidine rich polypeptides on Candida albicans [J]. Infect Immun, 1984, 44(3):702- 707.[3] FITZGERALD D H, COLEMAN D C, O' CONNELL B C. Susceptibility ofCandida dubliniensis to salivary histatin 3 [J]・ Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(1)：70-76[4] RUISSEN A L, GROENINK J, LOMMERSE C H, et al.Effects ofcarbohydrate polymers appli。