mda测定方法.doc

植物生理学实验丙二醛(MDA)的测定方法一、 实验原理植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有丙二醛、二烯轭合物、乙烷等其中丙二醛（MDA：Malondialdehyde）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可以通过检测MDA了解膜脂过氧化程度，以间接测定膜脂受损程度以及植物的抗逆性丙二醛在高温条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收根据其532nm处的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450nm处有以吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除二、 仪器设备紫外可见分光光度计；离心机；电子天平；研钵；恒温水浴锅；试管；剪刀三、主要试剂1、10%三氯乙酸（TCA）2、0.5%硫代巴比妥酸（用10％的三氯乙酸溶解）；3、石英砂四、实验材料正常生长以及受逆境胁迫的小麦叶片五、实验步骤   1. 取小麦不同部位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成0.5 cm长的小段，混匀2. 称取叶片切断0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入2 ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，4. 然后在 4℃，12, 000 g 离心 15 min，取上清。

  5. 吸取离心的上清液1.5 ml（对照加1.5 ml 10％ TCA），加同体积 0.5% TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应30 min，迅速冷却后再离心6. 取上清液测定532nm、450nm和600nm波长下的消光度六、计算含量根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：MDA浓度(μmol L-1) = 6.45*(OD535-OD600)-0.56*OD450  MDA含量 (μmol/g FW）= (MDA浓度(umol/L)*提取液体积(ml)) / 植物组织鲜重(g)七、 注意事项1. MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴15-30 min之内时间太短或太长均会引起532 nm下的光吸收值下降 2. 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心3. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收(最大吸收在450 nm)，当植物处于干旱，高温，低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。