间充质干细胞培养方法.doc

间充质干细胞培养方法1、间充质干细胞MSC基本形态2、干细胞应用与干细胞调控3、间充质干细胞MSC生长过程4、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境5、细胞培养板得选择6、如何选用细胞培养基7?、如何维持培养液pH8、血清与干细胞得培养9?、胎牛血清（FBS）就是否需要灭活1?0、细胞得细菌、真菌污染及排除？11、细胞培养污染得预防12、使用胰蛋白酶时加入EDTA得目得就是什么13、胶原酶得种类与选型1?4、胶原酶VS胰酶1?5、干细胞得种类与表面标记16、间质干细胞培养原理概述17?、间质干细胞成脂与成骨诱导分化1?8、干细胞老化得表现与处理19?、细胞传代消化过程指导20?、冷冻保护剂作用与选择21?、细胞冻存指导22、 干细胞冷冻与复苏23、 移植细胞得基因修饰1?间充质干细胞MSC基本形态？体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞悬浮型细胞在培养中悬浮生长.？间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同得突起。

可瞧到细胞成螺旋状生长2.干细胞应用与干细胞调控干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控，使之向指定得方向发展.？？2、1内源性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等另外，干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约1）胞内蛋白对干细胞分裂得调控？干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素Ao收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要比如在胚胎干细胞得发生中，转录因子Oct4就是必需得.Oct4就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子，它诱导表达得靶基因产物就是FGF—4等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。

Oct4缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团另外白血病抑制因子（LIF）对培养彳#小鼠ES细胞得自我更新有促进作用，而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得又如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.Tcf/Lef就是Wnt信号通路得中间介质，当与0—Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.?2、2外源性调控除内源性调控外，干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响1（?）分泌因子？间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞得增殖，分化与存活有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGF0家族与Wnt信号通路.比如TGF家族中至少有两个成员能够调节神经崎干细胞得分化最近研究发现，胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元得存活与分化，还对精原细胞得再生与分化有决定作用GDNF缺失得小鼠表现为干细胞数量得减少，而GDNF得过度表达导致未分化得精原细胞得累积Wnts得作用机制就是通过阻止0-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导得转录，促进干细胞得分化。

比如虫卵裂球得分裂中，邻近细胞诱导得Wnt信号通路能够控制纺锤体得起始点与内胚层得分化.?(2)膜蛋白介导得细胞间得相互作用有些信号就是通过细胞-细胞得直接接触起作用得3-Catenin就就是一种介导细胞粘附连接得结构成分除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响在果蝇得感觉器官前体细胞，脊椎动物得胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌与血液系统中,Notch信号都起着非常重要得作用当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞3)整合素(Integrin)与细胞外基质？整合素家族就是介导干细胞与细胞外基质粘附得最主要得分子整合素与其配体得相互作用为干细胞得非分化增殖提供了适当得微环境比如当B1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境得制约，分化成角质细胞此外细胞外基质通过调节”整合素得表达与激活，从而影响干细胞得分布与分化方向2、3干细胞得可塑性？越来越多得证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强得可塑性通常情况下，供体得干细胞在受体中分化为与其组织来源一致得细胞。

而在某些情况下干细胞得分化并不遵循这种规律1999年Goodell等人分离出小鼠得肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量得骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射得小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系这种现象被称为干细胞得横向分化(transdifferentiation)关于横向分化得调控机制目前还不清楚大多数观点认为干细胞得分化与微环境密切相关可能得机制就是，干细胞进入新得微环境后，对分化信号得反应受到周围正在进行分化得细胞得影响，从而对新得微环境中得调节信号做出反应.3间充质干细胞MSC生长过程？潜伏期-指数增生期-停滞期(1)潜伏期(latentphase)细胞接种后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态得悬浮期此时，细胞质回缩，胞体呈圆球形，然后细胞贴附于载体表面，称贴壁，悬浮期结束细胞贴壁速度与细胞种类，培养基成分，载体得理化性质等密切相关一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢，可达1024小时或更多，而传代细胞系贴壁速度快，通常10-30分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长与增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96小时或更长，连续细胞系与肿瘤细胞潜伏期短，仅需6—24小时。

2)指数增生期(1ogarithmicgrowthphase)这就是细胞增殖最旺盛得阶段，分裂相细胞增多指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长就是否旺盛得一个重要标志.通常以细胞分裂相指数(Mitoticindex,MI)表示，即细胞群中每1000个细胞中得分裂相数一般细胞得分裂指数介于0、1%-0、5%,原代细胞分裂指数较低，而连续细胞与肿瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%.指数增生期得细胞活力最好时期，就是进行各种实验最佳时期，也就是冻存细胞得最好时机.在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3—5天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contactinhibition)而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动与增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积(piledup)o细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多但就是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭与代谢产物得影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象(DensityInhibition)。

3)停滞期(Stagnatephase)细胞数量达到饱与密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期此时细胞数持平，故也称平台期(Plateauphase)停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动.如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重得会发生死亡，因此，应及时传代4.间充质干细胞MSC培养得合适气体环境干细胞相关得培养液都必须在5%CO2得气体环境中培养使用否则会对细胞产生影响气体就是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气与二氧化碳.氧气参与三竣酸循环，产生供给细胞生长增殖得能量与合成细胞生长所需用得各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中二氧化碳既就是细胞代谢产物也就是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中得主要作用在于维持培养基得pH值大多数细胞得适宜pH为7、2-7、4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害彳#影响一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长5.细胞培养板得选择？细胞培养板依底部形状得不同可分为平底与圆底(U型与V型);培养孔得孔数有6、12、24、48、96、384、1536孔等；根据材质得不同有Terasaki板与普通细胞培养板.具体选择时根据培养细胞得类型、所需培养体积及不同得实验目得而定.？(1)平底与圆底(U型与V型)培养板得区别与选择？不同形状得培养板有不同用途。

培养细胞，通常就是选用平底得，这样便于镜下观测、有明确得底面积、细胞培养液面高度相对一致因此做MTT等实验时，无论就是贴壁与悬浮细胞，一般选用平底板测吸光值一定要使用平底得培养板要特别注意材质，标示"TissueCulture(TC)Treated”就是养细胞用得U型或V型板，一般在某些特殊要求日寺才使用如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养畤，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用U型板,因为细胞会由于重力得作用而聚集在很小得范围内内圆底培养板还会用于同位素掺入得实验，需要用细胞收集仪收集细胞得培养，如混合淋巴细胞培养”等.V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验细胞杀伤这种实验也可用U型板替代(加入细胞后，低速离心)2)Terasaki板与普通细胞培养板得区别Terasakiplate主要就是用于晶体学研究，产品设计便于又t晶体得观察与结构分析有两种sitting与handingdrop两种方法，两种方法应用产品得外形结构也不同材料上选择crystalclasspolymer,特殊得材料有利观察晶体结构细胞培养板主要就是PS材料，材料就是treatedsufface,便于细胞贴壁生长与伸展。

当然还有浮游细胞得生长材料，同时还有1owbindingsurface?(3)细胞培养板与酶标板得区别？酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板与反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后得蛋白检测,需要更高得要求与特定得酶标工作液4)常用不同培养板得孔底面积及推荐加液量？不同孔板所加培养液得液面都不宜太深，一般在2〜3mm范围，结合不同孔得底面积就可算出各培养孔得适宜加液量(参考下表)若加液量过多会影响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染.具体所加细胞密度依实验得目得不同灵活掌握常用得培养器皿培养器皿底面积(cm2)加培养液量(mL)可获细胞量96?孔培养板0、320、110524孔培养板21、05X10512孔培养板4、52、0106?6孔培养板9、62、52、5X1064?孔培养板285、07X1063、5cm培养皿83、02、0X1066?cm培养皿215、05、2X1069?cm培养皿4910、012、2X1061?0cm培养皿5510、013、7X10625cm塑料培养瓶255、05、2X10675cm塑料培养瓶7515~302M0725cm玻璃培养瓶194、03X06100cm玻璃培养瓶37、510、06X106250cm玻璃培。