细胞培养_动物血清.doc

第一章第一章 动物血清动物血清有关血清的基本信息有关血清的基本信息40 年来，研究者依赖 Invitrogen 公司 GIBCO 血清在体外再造适于细胞生长、繁殖和 分化的生理环境在提供细胞培养基、平衡盐溶液和培养用试剂的同时，GIBCO 提供 高品质的血清GIBCO 自 1961 年开始生产用于细胞培养的动物血清，是此行业的开创 者在三十多年的岁月里，一直保持在技术和品质方面的领先水平，血清和培养基的 市场占有率常年蝉联全球第一GIBCOGIBCO 血清生产的纵向整体化管理血清生产的纵向整体化管理从血液收集到最终产品检验和内部稽核的每一个步骤，GIBCO 都采用专用设备和标准 操作程序，这种严格的控制可保证产品的高品质和最低的批间差 可追踪性：血清品质的证据可追踪性：血清品质的证据GIBCO 收集并保留从采血、处理、检测到发运的全部文件供追踪之用采采 血血胎牛血清采用心脏穿刺的方法采血马血清采自供体动物新生牛血清采自出生 10 至 14 天的小牛全部按照工业标准采血处处 理理全部血清：收集的血液均在冷藏条件下处理血清和凝块分离后立即将血清合并并冷 冻只有符合我们的检测标准的血清才被接受作进一步处理。

热灭活血清：热灭活是在 56℃水浴中严格控温 30 分钟超低 IgG 胎牛血清：我们持有从血清中通过层析方法去除 γ 球蛋白的专利经过这 种程序处理的血清只有极低的 IgG 浓度（小于 5µg/ml）但保持了血清的全部生物学活 性透析血清：用 12,000～14,000 截留分子量的透析膜对 0.15M 的 NaCl 进行透析直到葡 萄糖水平低于 5mg/dl(用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶方法检测)为防止沉淀和血清中 多肽的灭活，不进行过度的透析，因此一些小分子量的可透析成分如氨基酸不一定完 全去除γ 射线照射血清：可按客户要求对血清进行 γ 射线照射通过 γ 射线照射以灭活 各种动物血清中的病毒和支原体的方法已经得到证实研究证实照射剂量在 30-45kGy 为宜这一数据符合最新的欧洲和美国 FDA 的标准，证实血清被照射后物理化学特性和细胞培养表现没有改变装装 瓶瓶粗血清须通过一系列的过滤才成为成品最后的过滤步骤包括 0.2 微米和 0.1 微米的 无菌过滤胎牛血清须通过三次 100 纳米过滤GIBCO 的血清是在符合工业无菌标准 1000 级的严格操作条件下完成的最高的无菌标 准为 1000000 级，在没有终端灭菌的条件下是难以实现的。

控制无菌状态的关键在于 对所有与产品接触的材料的有效的灭菌程序、综合性环境监测程序、对最终过滤的整 体检测程序等此外，在正压条件下进行过滤和分装、HEPA 过滤、环境控制等也是重 要因素血清的包装采用 GIBCO 的 E-Z HOLD 塑料瓶在监测下进行灌装、标贴，并放置在- 5～-20℃的储存温度下直到质控报告完成，血清的品质被证实符合我们的标准后方 可出厂有效期限有效期限请参阅产品标签血清匹配和保留服务血清匹配和保留服务由于采用严格的生产流程而使得 GIBCO 血清的批间差降至最低但由于动物来源不同 而导致的生物化学性质的差异也是不可避免的GIBCO 提供两种免费的方式以减小这 种微小差异给您的研究带来的影响血清匹配程序：这一程序可以保证您所收到的血清具有您所要求的特性和培养表现 您只需简单地告诉我们您的要求，我们将向您提供与您的需求相匹配的某一批号血清 我们同样可以提供与您已经使用过的 GIBCO 血清相匹配的某一批号血清使用这一程 序，您将无须再做费时费力的批次检验工作，因为我们提供的血清与您的需求相匹配保留血清检验程序：对于一些极端敏感的应用，使用我们的保留血清检验程序可帮助 您获得一个样品以检测是否适用于您的培养。

在您对样品进行检测的同时，我们保留 您所指定数量的同一批号产品通常血清可保留 4 个星期，如您需更长的保留周期我 们亦可安排最终产品的质量控制最终产品的质量控制我们采取以下方法对每一批次的产品选取一定数量的样品进行质量控制分析化学检测化学检测渗透压：使用凝固点降低的方法检测渗透压我们每天使用美国国家标准技术研 究所标定的标准溶液对我们的渗透压检测仪器进行校准测定 pH 值：同样每天使用美国国家标准技术研究所标定的标准溶液对 pH 计进行 校准电泳图谱：鉴定血清的整体性质样品被加到醋酸纤维素介质中并在缓冲体系内 迁移条带经染色、清洁、干燥后用密度仪进行扫描以检测白蛋白和球蛋白组分 的相对浓度氧合血红蛋白检测：为证实是否在适当的条件下进行采血和处理，使用修饰的 Fleming 方法对血红蛋白进行分光光度检测血清总蛋白检测：随着动物年龄的增加血清总蛋白含量也相应地增加使用自动 化的 Biuret 方法进行总蛋白的测定以确证动物年龄免疫球蛋白的检测免疫球蛋白的检测我们利用高敏感度及高专一性的 ELISA 方法，来测定胎牛血清的免疫球蛋白 G 含 量稳定性检测程序稳定性检测程序在不同的时间间隔对产品进行检测，以确定在适当的储存条件下品质保证的最长 期限。

微生物检测微生物检测使用美国药典最新版推荐的方法进行微生物的检测以确定无细菌和真菌的污染所有的血清都使用 Barile 来自 stratium, substantia nigra, septum 和 cortex 原 代大鼠神经细胞Neurobasal™ Medium with: B-27 添加物17504044查 询 生长和维持 最小化神经胶质细胞的 增殖B-27 AO 是没有抗氧化剂的 B-27B-27 AO 添加物10889038查 询 原代大鼠胚胎海马神经元， 神经来源的肿瘤细胞系N2 添加物17502048查 询 B-27 AO 用来研究自由 基损害和凋亡 原代神经元的维持(低 蛋白，＜125mg/ml）（PC12, B104, N1E-115 和 NS20）神经肿瘤细胞系的生长 和维持原代神经胶质细胞和神经胶 质细胞，星形胶质细胞，小 神经胶质细胞，少突神经胶 质细胞来源的肿瘤细胞系 （U-251, MGsp, C6BD, RN- 22G5 添加物17503012查 询 生长和维持哺乳动物细胞哺乳动物细胞 哺乳动物细胞哺乳动物细胞无血清培养基无血清培养基产品目录号产品目录号 价价 格格应应 用用 原代和第二代人 脐静脉，微血管 和动脉的内皮细 胞原代人，猴和 大鼠肝脏细胞Human Endothelial-SFM11111044查 询 细胞的生长和维持，以进行细胞与细胞 之间的相互作用，损害分析，动脉硬化， 信号转导，细胞因子的产生和细胞基质 相互作用的研究。

原代人，猴和大 鼠肝脏细胞Heoatozyme-SFM17705021查 询 维持肝脏细胞（细胞色素 P450 保持＞9 天）17005042查 询 人表皮角化细胞 和子宫颈表皮细 胞（不支持成纤 维细胞和黑色素 细胞）Keratinocyte-SFM (with EGF, BPE)37010022查 询 细胞生长和维持，以进行皮肤替代物， 基因治疗和体外毒理学的研究人表皮角化细胞 和子宫颈表皮细 胞（不支持成纤 维细胞和黑色素 细胞）Defined Keratinocyte-SFM (without BPE)10744019查 询 进行子宫颈表皮细胞培养的低蛋白 （＜25µg/ml）培养基用于进行有关人 乳头瘤病毒的研究10829018查 询 胚胎干细胞Keratinocyte-SFM (without BPE) KnockOut™ D-MEM with KnockOut™ serum replacement10828028查 询 生长和维持用于各种用途的生产转基因 动物的未分化的 ES 细胞11681020查 询 12559027查 询 COS-7L, VERO, HEP-2 和 BHJ- 21（悬浮培养）VP-SFM, VP-SFM AGT™12559019查 询 低蛋白（5µg/ml）培养基，用于细胞生 长和病毒的生产。

MDCK, MDBK, BHK-21OptiPro™ SFM12309019查 询 低蛋白培养基，用于肾上皮细胞和表达 病毒相关细胞的培养BIOMANUFACTURINGBIOMANUFACTURING BULLETINBULLETIN单克隆抗体生产的关键技术单克隆抗体生产的关键技术上游的决定通常会影响下游的生产——可能更好或更坏当您选择 GIBCO 产品时，您就获得了我们的资 源以支持您未来的工业应用当您的生产规模放大时，我们将改动我们的技术以适应您的需求在细胞培养方面的革新作为全球最大的细胞培养基生产商，GIBCO 研制并发展了各种培养基，并已优化使细胞适应时间减至最 低CHOCHO 培养基和细胞系培养基和细胞系中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是最常用于重组蛋白的表达和单克隆抗体生产的细胞系可在悬浮培养条件下 生长到高密度、可对表达和分泌的蛋白进行适当的转录后修饰（包括糖基化）等特性，使得 CHO 细胞成 为许多抗体和用于人类治疗目的的蛋白质生产的首选（图图 1 1）重组的 CHO 细胞可成功地以贴壁或悬浮方式大规模生长对无血清、无蛋白、限定化学成分的培养条件 的使用趋势使得贴壁细胞的使用更加困难而悬浮细胞的使用逐步增长。

GIBCO 发展了多种用于大规模悬浮培养的无血清培养基：CDCD CHOCHO 是限定化学成分的无蛋白培养基，不含谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶它不含有任何直接的动 物来源成分（图图 2 2 和图图 3 3）CHO-S-SFMCHO-S-SFM 是一种低蛋白（90% 活细胞率 3.适应时以较高的起始细胞接种下面是适应的一般步骤 起始细胞接种、细胞产量和培养周期作为连续优化的起始点直接适应直接适应一些类型的细胞可以直接从包含血清的培养基适应无血清培养基对于直接适应，接种细胞密度应该是 2.5×10 到 3.5×10 细胞/ml当细胞密度达到 1×10 到 3×10 细胞/ml 时，传代培养细胞当细胞密度在培养 4 到 7 天后达到 2×10 到 4×10 细胞/ml 时，细胞完全适应了无血清培养基每隔 3 到 5 天，当细胞密度达到 1×10 到 3×10 细胞/ml，细胞活率在 90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞 培养物应该再次传代培养连续适应连续适应1.以 2 倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到 75%有血清培养基：25％SFM 混合培养 基中，传代培养2.当细胞密度>5×10 细胞/ml 时，以 2×10 到 3×10 细胞/ml 细胞密度，在有血清培养 基：SFM 为 50∶50 的混合培养基中传代培养。

3.以 2×10 到 3×10 细胞/ml 细胞密度，25％有血清培养基和 75% SFM 中传代培养 4.当细胞密度达到 1×10 到 3×10 细胞/ml（接种后 4 到 6 天），在 100％SFM 培养基中传 代培养5.每隔 3 到 5 天，当细胞密度达到 1×10 到 3×10 细胞/ml，细胞活率在 90％时，贮备的 适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养注释：建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基每一 次减少血清前，可能需要在 SFM/有血清混合培养基中进行几次传代 在适应过程中，最好不要让细胞生长过度这将增加选择亚群的可能性需要注意，与有 血清培养基相比，大部分 SFM 包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响细胞培养适应替代血清细胞培养适应替代血清许多细胞利用连续适应的方法能够很好的适应，用包含 FBS 的当前的培养基和包含有替代血清的培养基 1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量： 1∶2，1∶4，1∶16 和 100％替代培养基在每一次适应改变血清比例时，传代细胞。