实验3---培养基的配制及消毒灭菌.doc

实验3 培养基的配制及消毒灭菌 第一讲、培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制2．高氏1号培养基的配制3．马丁氏培养基的配制二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6 1．称药品 　按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。

若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分3． 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节pH的调节通常放在加琼脂之前应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度4．过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察但是供一般使用的培养基，这步可省略5．分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝6．加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。

有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞7．包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期8．灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存9．摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/210．无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用二）高氏l号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6 l．称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。

再加入其他成分依次溶解对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制2．pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基其配方如下：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH1．称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制 3．链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素30μg。

四、注意事项 称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖调pH时要小心操作，避免回调不同培养基各有配制特点，要注意具体操作五、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点六、问题和思考l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查? 3．试设计实验对饮料进行无菌检查第二讲 消毒与灭菌一、干热灭菌（一）目的要求1．了解干热灭菌的原理和应用范围2．学习干热灭菌的操作技术二）基本原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧干热灭菌使用的电烘箱的结构如图3-1三）器材培养皿、试管、吸管、电烘箱等四）操作步骤1．装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。

物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火2．升温接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升当温度升至100℃时，关闭排气孔在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度3．恒温当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h干热火菌过程严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故4．降温切断电源、自然降温5．开箱取物待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂五）实验报告思考题l．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?2．为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案图3-1 电烘箱的外观和结构A.外观 B.结构1.温度计; 2.排气阀; 3.箱体; 4.控温器旋钮; 5.箱门; 6.指示灯; 7.加热开关; 8.温度控制阀; 9.控制室; 10.侧门; 11.工作室; 12. 保温室; 13.电热器; 14. 散热板; 15.搁板二 高压蒸气灭菌（一）目的要求1．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。

2．学习高压蒸气灭菌的操作方法二）基本原理高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表3-1），二是湿热的穿透力比干热大（表3-2），三是湿热的蒸气有潜热存在1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表3-3）表3-1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574～801880～9061450160～170表3-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较温度/℃时间/h透过布层的温度/℃灭菌20层10层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.33101101101完全表3-3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度/℃2/3空气排出时的温度/℃1/2空气排出时的温度/℃1/3空气排出时的温度/℃空气全不排出时的温度/℃MpaKg/cm2Ib/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.1010.515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可达到彻底灭菌的目的。

灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图3-2，A）和手提式（图3-2，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书三）器材牛肉膏蛋白胨培。