多糖的提取和纯化.doc

多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50°C，以防止糖昔键断裂稀碱法适合于提取碱溶性糖然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天第四步是沉淀多糖大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小,所以可用有机溶剂来沉淀常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖,制得粗多糖最后是除去蛋白质除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖纯化方法很多，主要纯化方法有:(1)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。

纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成因此，测得的分子量一般为平均分子量过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好1.2.1发酵、提取取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25C下通气培养72h,压滤，得香菇深层培养菌丝体上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100C)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙醇，离心得乙醇沉淀物一Le[‘'2分离、纯化取Le上样于DEAE—纤维素柱上，用OOlmol/LpH6.95Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液,经浓缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2・Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的O.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱，后用含lmol/LNaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液•用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含lmol/LNaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o1.2.3鉴定1.2.3.1纯度(l)HPLC法将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。

流动相:0.002mol/LNaAc;速:0.6ml/min记录色谱曲线和样品保留时间(Tr)2)醋酸纤维薄膜电泳缓冲液:pH8.6巴比妥缓冲液•电压12OV,25min.阿利新蓝法染色.1・2・3.2分子量测定用T系列标准葡聚糖(T-40:44,400Da；T-70:85,000Da；T-110:110,000Da;T-500:450，000Da)上HPLC柱，测出保留时间后对分子量对数作出标准曲线.然后根据样品的保留时间，从标准曲线上求出样品分子量3.3单糖组成(1) 薄层层析将Le一2一1及Le-2一2分别用三氟醋酸在110°C下水解4h.蒸去三氟醋酸并蒸干，用3ml水溶解后点样层析板:醋酸纤维素层析板(DC—AufolienCelluloseF);展开剂:正丁醇(BuOH):毗唆(Py):水(HZO)二6:4‘3;显色剂:苯胺一邻苯二甲酸.(2) 气相色谱取上述水解液加IOmgNaBH在室温下还原Zh,用冰醋酸调pH至5,减压蒸干后加lml乙酸配，100C水浴lh,进行乙酞化处理，将乙酸化产物的氯仿抽提液作气相色谱分析，柱温205C，气化温度250Co1‘3.1多糖的分离、纯化将长裙竹荪子实体干品洗净、剪碎，用5倍的3%三氯乙酸溶液于5C提取8h，离心，收集上清液，用4NNaOH溶液中和上清液至pH7,浓缩、离心，上清液加3倍体积的95%乙醇沉淀，收集沉淀物，冷冻干燥得粗多糖，得率约为8%.粗多糖含蛋白质较多，采用蛋白酶法脱蛋白一次，Sevag法脱蛋白5次,去蛋白液经透析，加3倍体积95%乙醇沉淀，水溶解，再醇析，反复三次得脱蛋白多糖。

脱蛋白后的多糖(2.0g)溶于水(1Oml)中，用DEAE一纤维素(Cl-)型柱(3.3X53cm)层析，用水作洗脱剂，分部收集，每管10ml,用硫酸一苯酚法测定多糖的分布合并多糖单一峰位部分，减压浓缩至5ml，再进行一次DEAE一纤维素(B4O72-型)柱(1.8x50cm)层析，用水作洗脱剂.分部收集，用硫酸一苯酚法测定多糖分布.合并单峰洗脱液，浓缩至小体积，用SephadexG一200柱(2.OX5ocm)进一步纯化用o.05mol/1NaCI溶液作洗脱剂，用硫酸一苯酚法测定多糖分布，合并单峰洗脱液，透析去盐，浓缩，再加3倍体积的95师乙醇沉淀，沉淀物经冷冻干燥得到多糖，命名为DIAo1.3.2纯度鉴定聚丙烯酞胺凝胶电泳按文献方法进行.阿利新蓝染色醋酸纤维薄膜电泳按文献方法进行，缓冲液为o.025mol/lpHg.0的硼砂缓冲液，纸scm，电压160V,电泳50min,阿利新蓝染色凝胶过滤法采用Sepharose4B柱(79X1.6cm)进行凝胶层析，用蒸馏水洗脱，硫酸一苯酚法隔管测定多糖的分布紫外分光光度法采)JIUV一300进行扫描(200—400nm)观察260nm、280nm处是否有吸收峰。

根据上述测定结果，鉴定多糖的纯化1.3.3分子量测定采用Sepharose4B凝胶柱(79x1.6cm)层析，洗脱剂为蒸馏水，洗脱速度为3ml/8min,分部收集，用硫酸一苯酚法测定多糖的分布再以标准葡聚糖T一40(44.4Kd)、T一70(85Kd)、T一110(110Kd)和T一500(45Kd)分别重复上柱，测得各自的洗脱体积Ve，以LogM.W.对洗脱体积VO作图得标准l山线山多糖DIA的洗脱体积，查标准曲线图，求得该多糖的分子量1.3.5纸层析分析多糖DiA用2NH2SO4封管，100水解6h，水解液用BaC03中和、过滤、浓缩后点样分析采川新华中速层析滤纸，下行法溶剂系统为醋酸乙酯:吡啶，水=10，4，3;显色剂为苯胺一邻苯二甲酸干品洗净剪碎——5倍蒸馏水，98-100提取5h纱布粗滤，离心3000转份——上清液适当浓缩，加3倍95乙醇沉淀，离心3000转/分一一沉淀冻干一一粗多糖蛋白酶法和sevag法脱蛋白脱蛋白多糖SephadexA-25柱层析，先用0.1mol/LNaCl洗至无糖检出，再用0.1-3.9mol/LNaCl梯度洗脱——含糖部分SephadexG-200柱层析0.1mol/LNaCl洗脱——多糖纯品Sevag法(即氯仿与正丁醇的比例为3:1)脱蛋白，振摇0.5h左右,使样品中蛋白质与混合液形成凝胶,再反复多次用离心法除去。

1多糖研究概述1.1 多糖提取：多糖多为水溶性多糖，组分不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂多糖的提取一般分三步进行浸提：一般采用冷水或温水浸提浸提一段时间后，加乙醇或丙酮深淀，离心分离沉淀用乙醇或乙醚脱水，最后真空干燥或冷冻干燥后得粗多糖脱蛋白：用丧Sevag法(即氯仿与正丁醇的比例为3:1)脱蛋白，振摇0.5h左右，使样品中蛋白质与混合液形成凝胶，再反复多次用离心法除去也可用三氯醋酸法，三氟三氯乙烷脱蛋白纯化：多糖纯化多采用柱层所脱蛋白后的多糖用水溶解后，用DEVE纤维素柱层析，然后依次用不同浓度的NavSUB>2v/SUB>COvSUB>3v/SUB>,NaOH洗脱此外，纯化还可采取凝胶柱层析法，超滤法等1.2 多糖分子量的测定：所谓多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组分，因此测定的多糖分子量为平均值以前多采用蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差很大目前常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于一百万的多糖，用高压液相法为最好1.3 多糖结构的确定：多糖的活性与其结构有关，但确定多糖的细微结构是很难的，原因是分级纯化难关，从自然界分离的粗多糖是非常复杂的大混合物，包括生物大分子混合；不同多糖(中性多糖、酸性多糖或杂多糖)的混合；同种多糖大小分子的混合，必须采取适合特点的方法分离分级纯化，否则不易确定其结构。

从同一样品采用不同分级方法，常有不同结果植物的不同部位，因功能不同，其中的多糖也是各色各样的，必须分开来研究比如人参的根、茎、叶、果中的多糖，虽都含有中性杂多糖、酸性杂多糖组分，其组成与结构都是不同的在人参茎、叶、果的中性杂多糖、酸性杂多糖组成中都有葡萄糖，而根的中性杂多糖、酸性杂多糖组成中都没有葡萄糖，而只有以葡萄糖为主链的类淀粉多糖储存在根部多糖结构确定有化学降解法、酶降解法、免疫化学法、放射化学法、红外光谱法、核磁共振法、气相层析法、质谱法、质谱与气相层联用、高效液相色谱法等，要完成对多糖整体结构的分析，必须将各种方法结合起来多糖的结构研究，还不能忽视金属离子的贡献，多糖链中含烃基、乙酰基、氨基、硫酸基等易与多种金属离子形成络合物多糖在自然环境中是否与金属离子有关系，如何才会是其最佳状态，也是应考虑的金属离子的加入或可能是多糖的活性中心的成员，金属离子的存在因络合多糖链而会影响构象变化多糖的结构确定与生物活性测试后，研究者的进一步是研究其构象、大分子间相互影响、活性中心、金属离子影响以及化学修饰的研究，从不则角度来阐明结构与功能的关系2.1工艺流程银耳抱子发酵粉-热水煮提-冷却离心-沉淀加一定浓度NaOH液搅拌，离心一上清液一3V乙醇沉析一多糖沉淀一多糖粗品一蒸馏水加热溶解一冷却离心一上清液fSevag法除蛋白—离心取上清液—减压浓缩—蒸馏水透析—透析袋内容液—3V乙醇沉析多糖f沉淀f真空干燥f精制多糖f离子交换层析(DEAE-32-Cellu-lose)—洗脱液—减压浓缩—3V乙醇沉析多糖—沉淀—银耳碱提取多糖—离子交换层析纯化(DEAE-32-Cellulose)—洗脱液—减压浓缩—3V乙醇沉析多糖—沉淀干燥—均一体银耳碱提取多糖。

2.2.1水提取取300g银耳抱子发酵粉(中国医学科学院生物扶研究所药厂提供)，加入10倍量的水，煮提约4h煮后放冷，将提取液离心(15min,4000r/min)提取后的残渣加入约10倍的水，以相同的方法煮提2次并离心分离，收集沉淀合并3次所得的上清液，浓缩至小体积后放置，另作它用取少许沉淀，加入水搅拌溶解后离心(15min,4000r/min)，用苯酚-硫酸法检测上清液反应阴性将所得沉淀于50烘箱中烘干，粗多糖重量为188.8g2.2.2碱液提取取140g粗多糖，加入0.5mol/LNa0H1000ml,搅拦提取6h，离心15min，沉淀以相同的方法再提取2次，合并3次所得的提取液，沉淀另置将提取液减压浓缩至约原体积的1/3,以1mol/L的HCl中和至pH=7,中和液减压浓缩至小体积浓缩后的中和液用流动水透析3天透析后的溶液用3V85%乙醇沉析，离心15min收集沉淀，得到0.5mol/LNaOH提取的碱溶性多糖(62g)0.5mol/LNaOH提取后的粗多糖，。