临床医学论文遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析.doc

临床医学论文•遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析作者：李敏，王丽君，张彩娥，吴雄文，邓云华【摘要】 冃的：通过对一遗传性对称性色素异常症家系的致病基因DSRAD进 行检测，以期寻找到新的致病突变.方法：采用RT PCR方法从人外周血中获 得DSRAD基因cDNA，然后克隆至pTA2 vector,^阳性克隆筛选后进行基因序列 测定，通过BLAST程序网上比对找出可能突变位点，再采用单链构象多态性技术 进行新突变验证.结果：对该家系DSRAD基因测序发现患者存在碱基替换 A1167G(Q389Q)，由于编码的氨基酸未改变，均为谷氨酰胺，为一种同义突变.经 单链构象多态性分析证明该突变只存在于该家系患者，不存在于家系健康人和 100名无亲缘关系对照者.结论：该同义突变可能导致患者皮肤色素异常改变， 其具体的机制尙需进一步硏究.【关键词】 遗传性对称性色素异常症；突变；DSRAD基因；cDNA克隆；聚合酶 链反应；多态现象，单链构象0引言遗传性对称性色素异常症(dyschromatosi s symmetrical heredi taria,DSH)，1924年首先由Toyama等在日本报道•该病主要发生于日本和中国，另 外韩国、印度、欧洲和北美也有少量报道〔1〕・DSH多为常染色体显性遗传， 具有较高的外显率，亦有散发患者和常染色体隐性遗传的报道〔2〕，其发病机 制尙不清楚.近年来，国内外多个硏究小组对该症进行了系列遗传学硏究，最终 确定了致病基因为双链RNA特异性腺苗脫氨酶(double strandedRNA specific adenosine deaminase, DSRAD)〔3〕・到目前为止，在DSH患者中共发现40余 种DSRAD基因的突变.为完善该症的突变谱，我们对一个DSH家系的DSRAD基因 进行了突变检测，硏究DSRAD基因的突变位点在皮肤的色索代谢中可能起到的作 用.1对象和方法1・1对象本硏究中家系3代，共11人，其中6例患者(图1).先证者：女,9 岁，体格发育和智力与同龄人相仿，未发现明显的系统症状.3岁时出现手背散 在色索减退斑，随着年龄增大，色索减退斑越来越明显，并夹杂色索沉着斑点， 丿支损缓慢蔓延，目前巳侵及手腕部及右脚踝，皮损夏季明显而冬季减轻.先证者 的母亲(H 2)自述3岁左右开始出现皮损，目前色素异常性皮损主要位于手足 背，呈对称性分布，面部有少量雀斑样皮损.先证者的舅舅(II 1 )及其儿子(III 2)女儿(III 3)有类似表型，于四肢末端陆续出现深浅不一的色素减退斑，间杂褐色斑片，其临床表现符合DSH.所有患者黏膜、指(趾)甲、牙齿和 毛发均正常.图1DSH家系图1・2方法1.2.1遗传物质的获取获得知情同意后，无菌采集该家系成员静脉血5 mL ‘常规提取基因组DNA ；同时还采集先症者匀…名正常家系成员静脉血5 mL以提 取mRNA. 100名对照（以排除可能存在的基因多态性）来自湖北及周边地区的正 常人，未发现有色素异常.1.2.2引物设计与合成根据GenBank中公布的人DSRAD基因的cDNA序列通 ^PrimerS.0软件设计3对PCR特异性引物扩增该基因全长，由上海英骏生物技 术有限公司合成.引物序列如下：第1对：上游引物P1 : 5 GGAGTAGCGGAGGCGTGG 3 "，下游引物 P2 : 5 OTGCTGGTTCTGGTCTGGC 3 “ ；第 2 对：上游引物 P1 : 5 GTGGAGAATGGGCAGGAA 3 ，下游引物 P2 : 5 AGCAAGGAGGGCTGGAAG 3 “ 第 3 对:上游引物 P1 ：5 “ TCTCACTGGCAGCACCTT 3 “， 下游引物P2 : 5 CCATCTGTCACTGGAGCAT 3 •扩增片段大小分别为1400, 1400 和 1290 bp.依据比对分析结果，拟对突变部位迸行单链构象多态性分析的引物序列 为：上游引物 P1: 5 TTGACAGACAAGAAGCGAG 3 ，下游引物 P2: 5 CTGCCCATTCTCCACTTT 3 ・其扩增产物长度是177 bp.1.2.3RT RCR扩增DSRAD基因分离白细胞，用TrizoL—步法抽捉基因组 mRNA，按照逆转录试剂盒将总的mRNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR 扩增，PCR 反应体系包 4 /zL 5xbuffer（含Mg2+），2 /zL dNTP J 4 /zL cDNA J 上下游引物各1 "L，1.5 /zLTag酶，加双蒸水至20 “L. PCR反应条件为96C 预变性3 min,然后96匕变性1 min,退火55C 60 s,延伸72C 2 min,共30个 循环 最后72CW10min. PCR产物取5 "L以10g/L的琼脂糖电泳Go 1 dvicw染色，凝胶电泳图像分析系统分析鉴定.1.2.4DSRAD基因的克隆将DSRAD基因PCR产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 在紫外灯下切取含有0的条带的琼脂糖凝胶块，按胶回收试剂盒说明书中的方法, 冋收胶块中的目的片断，将冋收产物与PTA2载体于16t连接18 h，取连接产物 10 “L加至100 “L感受态DH5d大肠杆菌，冰浴30 min，42C热击90 s,再冰 浴2 min后加入800 “L的LB培养液37C振摇45 min，取菌液200 “L涂布于 含有氨节青霉素X gal和IPTG的LB平板37C过夜，次日经蓝白筛选，随机 挑取5个白色菌落，分别转种含氨节青霉素100 mg/L的3 niL LB培养基，37C振 摇6 h后，分别以DSRAD弓［物进行菌落PCR，鉴定出目的基因的阳性克隆.1.2.5DSRAD的序列测定与分析将经过鉴定的阳性克隆送上海英骏生物技术 有限公司进行双向反应测序，将测序结果通过BLAST程序网上比对找出可能的突 变位点.1.2.6 单链构象多态性分析(Single St rand Con format ion Polymorphi sm analysis, SSCP)在DSRAD基因上设计一段包含突变位点的177 bp的片段用于 PCR SSCP分析 何时对100个正常人的DNA进行同样条件的SSCP分析.将PCR 扩增产物变性5 min,立即冰浴10 min，使用12 mol/L非变性聚丙烯酰胺凝胶， 于40，80 V电泳6 h后银染，观察有无异常条带.2结果本硏究采用RT RCR法克隆DSRAD基因后，将测序结果通过BLAST比对，发现DSRAD基因的第1167位碱基(以起始密码子ATG之A为第一位)存在可疑突 变该位点腺瞟口令(A)转换成鸟瞟口令(G)，导致第389位密码子由CAA-CAG(图2) 但编码的氨基酸未改变，均为谷氨酰胺(Q389Q)・SSCP分析发现该家 系患者存在异常电泳条带(图3) 家系正常成员和100名无亲缘关系的正常人 无此改变.3讨论该家系临床诊断为DSH，具有典型的临床表现和常染色体显性遗传特征.本 病主要鉴别诊断为遗传性弥漫性色素界常(DUH)，后者曾被认为是DSH的另一种 亚型，但目前硏究已经证实二者具有不同的分子遗传学基础〔4〕.2003年高敏等〔4〕将本病定位在1号染色体长臂lqll lq21的11.6厘 摩的区间内；同年Miyamura等〔3废现了本病的致病基因是位于该区间的DSRAD， 乂称ADAR基因，该基因是ADAR家族中的一员，该家族成员广泛存在于从线虫到 人的各种生物中，其主要生物学功能包括RNA编辑和诱导蛋白质在核内的翻译. 基因全长约30 kb,共有15个外显子，最长的转录本约6.7 kb，编码含有1226 个氨基酸序列的双链RNA特异性腺甘脫氨酶，该酶可选择性地将Pre mRNA上 的腺喋岭核昔(A)脫氨基转换成次黄喋U令核昔(I)，后者在碱基配对中相当于鸟嚟 卩令(G)和胞喘碇(C)配对，导致转录的mRNA所翻译的氨基酸序列勻DNA所对应的 有所不同，并产生特定的生理效应〔5〕・已有硏究证实该酶有3个功能域，依次 为2个Z alpha区，是2个Z DNA结合功能域，引导该蛋白靠近正在转录 的DNA，以便对底物RNA发生作用〔6〕； 3个双链RNA结合亚区，由2号外显子 到7号外显子所编码，主要进行识别底物并结合底物的作用；1个月泉甘脫氨催化 区，由8号外显子到15号外显子的起始区域编码，实现腺莒的脫氨基作用〔7〕.Cho等〔8〕通过对DSRAD蛋白的硏究发现该酶是以二聚体的形式发生活性作用 的，其蛋白单体的N末端和第一个双链RNA结合功能域是形成二聚体的关键. 若突变的染色单体编码了一个缺陷的蛋白，不能形成有效的二聚体形式，无法发 挥其正常功能，即可能导致疾病的发生.自该疾病致病基因发现以来，不断的冇基因突变的报道.常见的突变类型是 点突变，多为错义突变，其次是碱基缺失或插入，可引起移码突变或无义突变， 鲜见有同义突变的报道.本实验硏究采用RT PCR方法对DSRAD基因进行了全 克隆与序列测定，再以PCR SSCP技术进行突变鉴定，发现该家系中所冇患者 存在第1167位碱基(2号外显子第1136碱基)由A替换为G，家系正常成员和100 名无亲缘关系的正常对照均不存在吐改变，由于该突变并不引起所编码的氨基酸 的改变，均为谷氨酰胺5为一同义突变.同义突变虽未改变氨基酸的序列，但核 酸改变可能影响转录效率，并且同一氨基酸其简并密码子的翻译效率不同，可能 使蛋白质表达量改变，最终导致疾病的发生〔9〕・该同义突变是否影响DSRAD 基因功能尙需进一步硏究.DSRAD基因的突变分析，为遗传性对称性色素异常症捉供了从分子水平确诊 的新技术，对临床拟诊的遗传性对称性色索异常症患者及其亲属进DSRAD基因的 检测，不但可以对典型的患者作出诊断，而且对轻型及无症状者可以做到早期诊 断，有利于在家系内开展有效的遗传咨询.【参考文献】〔1〕Oyama M, Shimizu H, Ohata Y, ct dl. Dyschromatosis Symmetrica he redi taria(reticulate acropigmentat ion of Doh i): Report of a Japanese family with the condition and a 1iterature review of 185 cases〔J〕・ BrJ Dermatol, 1999,140(3):491-496.〔2〕Alfadley A, Al Aj lan A, Hainau B, et al ・ Reticulate acropigmentaion of Dohi: A case report of autosomal recessive inheritance〔J〕・ J Am Acad Dermatol, 2000,43(1 Pl 1):113-117.〔3〕Miyamura Y, Suzuki T, Kono M, et al. Mutat ions of the RNA specific adenosine deaminasegene (DSRAD) are involved in dyschromatosis symmetrica hereditaria 〔J〕・ Am J Hum Genet, 2003,73(3):693-699・〔4〕高敏，张学军，李明，等.全基因组扫描定位遗传性对称性色素异常症易 感区域〔J〕・中华皮肤科杂志，2003, 36(3): 675-678・[5〕Herbert A, Wagner S, Nickerson J A. Induction of protein t ranslat ion by AD。