第3章 微生物细胞的破碎技术 2005.06.doc

第3章 微生物细胞的破碎知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择难点：常用破碎方法的合理选用一．细胞的破碎技术概述采用微生物发酵或动植物细胞培养时，如果目标生化物质为胞外产物，如霉菌产生的糖化酶等，提取过程较简单，只需直接进行固-液分离，获得澄清的滤液，再进行分离纯化操作；如果目标生化物质为胞内产物，如碱性磷酸酶等胞内酶、部分外源基因表达产物或植物细胞产物等，则要对菌体或细胞进行适当的处理，选择性地释放目标生化物质到液相中，然后进行固-液分离去除细胞及其碎片，再进行目标生化物质的分离纯化由于细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物和微生物细胞的结构差异很大动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎植物细胞和微生物细胞有一层坚固的细胞壁，破碎困难，需用较强烈的破碎方法因此，本课程主要介绍微生物细胞的破碎技术所谓的微生物细胞破碎就是使微生物的细胞壁或细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，增大胞膜通透性，使胞内产物获得最大程度的释放,便于所需的生化物质的提取和分离的一种操作本质上这是一种增溶作用，其主要阻力来自于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异。

由于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异导致细胞破碎的难易程度不同因此，了解微生物细胞壁结构和强度对判断细胞破碎的难易程度和选择合适的细胞破碎方法有着十分重要的意义表1所示为各种微生物细胞壁的结构和组成表1 各种微生物细胞壁的结构与组成微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20～8010～13100～300100～250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40%～90%）酯多糖（1%～4%）多糖细胞酸蛋白质肽聚糖（5%～10%）酯多糖（11%～22%）酯蛋白磷脂蛋白质葡聚糖（30%～40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6%～8%）脂类（8%～14%）多聚糖(80%～90%)脂类蛋白质由表1可知，微生物的细胞壁都是由网状的高分于聚合物构成，破碎的难易程度主要取决于构成细胞壁的聚合物的种类以及细胞壁的厚度和强度如革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎酵母的细胞壁的厚度甚至超过革兰氏阳性菌的细胞壁，更难破碎几乎所有细菌的细胞壁都是由具有网状结构的肽聚糖组成，肽聚糖包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度破碎细菌的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。

酵母细胞壁的主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、脂类和蛋白质等，仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度大多数霉菌的细胞壁主要由多糖，尤其是具有β-1，4糖苷键的几丁质和β-1，6糖苷键的葡聚糖组成，还含有较少量的蛋白质和脂类破碎霉菌细胞壁的阻力主要决定于霉菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构，还有几丁质或纤维素的纤维状结构海藻类的细胞壁非常复杂，主要结构成分是纤维状的多糖类物质破碎海藻细胞壁的阻力主要取决于纤维素的β-1，4糖苷键结构因此，微生物破碎的难易程度主要取决于构成细胞壁的高分子聚合物的种类以及细胞壁的厚度和强度，为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键在破碎中，细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度均是影响破碎难易程度的重要因素在用酶法或化学法破碎时，细胞壁结构和组成可作为选择酶或化学试剂的依据，如革兰氏阳性菌主要由肽聚糖组成，可直接采用溶菌酶裂解β-1，4糖苷键进行破壁，而革兰氏阴性菌因存在脂蛋白和脂多糖，则只有在螯合剂存在时才能受溶菌酶作用二．胞破碎的原则破碎细胞的目的是要得到一种或几种有用的目标生化物质由于细胞之间以及目标生化物质之间的性质差别很大，已有的破碎理论和破碎实验数据只能作为指导破碎操作的参考依据，实际的破碎操作仍需凭借经验，即需通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作条件，获得最佳的破碎效率。

因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标生化物质，而使其他物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，在保证目标生化物质有较高收率的前提下，使下游加工过程的成本最低这对下游分离纯化操作的顺利实施是非常重要的如利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速度常数不同一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来选择性地释放目标生化物质的关键是要根据目标生化物质的性质和在细胞内存在的位置来选择适当的破碎方法和操作条件一般原则有以下两个方面：①仅破坏或破碎存在目标生化物质的位置周围：当目标生化物质存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶解法、渗透压冲击法和冻结-融化法等当目标生化物质存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法②选择性溶解目标生化物质：当目标生化物质处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调整溶液pH值、离子强度或添加与目标生化物质具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等使目标生化物质容易溶解释放所选的溶液体系应使其他杂质不易溶出三．破碎率的测定破碎细胞仅为目标生化物质的释放创造了条件，而不是最终目的破碎细胞的目的是释出目标生化物质，因此，细胞的破碎速率一般用目标生化物质的释放速率评价。

由于破碎方法、细胞种类和目标生化物质在胞内位置不同，目标生化物质的溶解速率也不同，因此，细胞破碎和产物溶解过程非常复杂，很难完全定量描述为了测定细胞破碎的程度，可采用以下2种方法：①直接测定法：利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞的量，可用于破碎前的细胞计量采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开来，以便于计数例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色②测定释放的蛋白质量或酶的活力：细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率通常将破碎后的细胞悬浮液离、测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100%破碎所获得的标准数值直接比较细胞破碎和产物溶解过程非常复杂，很难完全定量描述四．常用破碎技术细胞破碎的目的是选择性释出胞内产物，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类（表1）机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，非机械破碎主要利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜的结构而释放胞内物质表1 机械破碎法与非机械法比较[2]比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜破片大小碎片细小细胞碎片较大内含物释放全 部部 分粘 度高（核酸多）低（核酸少）时间、效率时间短、效率高时间长、效率低设 备需专用设备不需专用设备通用性强差经 济成本低成本高应用范围实验室、工业范围实验室范围不管是机械法还是非机械法，各种方法都有自身的局限性。

多种破碎方法相结合是一个发展方向微生物细胞破碎技术的未来发展方向主要集中在如下几个方面：①多种破碎方法相结合：如机械破碎前，先用硫醇处理酵母细胞，利用酶活激活糖苷酶，从而去除细胞壁中得的糖，使细胞壁强度减弱，可以大大提高胞内蛋白的收率如：用溶菌酶预处理面包酵母，然后采用高压匀浆机，在9.5 MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100％，而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32％②与上游过程相结合：菌体破碎的难易程度与发酵培养过程的条件息息相关可通过改变培养基的组成、发酵条件等因素或者利用基因工程方法对菌种进行改造如：克隆噬菌体溶解基因，表达耐高温产品的基因等③与下游过程相结合：从整体角度考虑细胞的破碎程度，避免因细小碎片无法除净而导致后续的固液分离和纯化过程的难度增大表3则列出了细胞破碎一些主要方法，其中高速湿法珠磨法和高压匀浆法已经在工业生产中广泛应用，酶解法和化学溶胞法也大量应用于实验室规模的细胞破碎中，超声破碎法和微波破碎法的实验室研究开发相当活跃表3 细胞破碎主要方法[ ]分类作用机理适应性（或选用策略）机械法高速湿法珠磨固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压均浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作非机械法酶解法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学溶胞法改变细胞膜的渗透性具有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压冲击法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目的产物干燥法改变细胞膜的渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 细胞破碎主要采用各种机械破碎法和非机械破碎法，或机械和非机械破碎法的结合。

机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，非机械破碎主要以化学渗透的方式起作用，系利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜的结构而释放胞内物质各种作用力的细胞破碎机理示于图2图2 细胞破碎机理1）机械破碎法机械破碎法是工业规模细胞破碎的主要手段，具有处理量大、破碎效率高、速度快等特点，适用于植物材料和细菌细胞的破碎其破碎原理主要基于对物料的液相或固相剪切作用这些剪切力可以在高压匀浆器、高速珠磨机、胶质磨或高速组织捣碎机等设备中获得由于各种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范围和处理规模因此，针对目标生化物质的性质选择细胞破碎设备并确定适宜的破碎操作条件是非常重要的但由于这种剪切力场之间的相互作用较复杂，工程设计大多数靠经验本法常用的设备有细菌磨，高速珠磨机(图1)，胶质磨，撞击破碎器(图2)，高速组织捣碎机，匀浆器(图3)和电声超声波发生器(图4)等研磨法是将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，利用玻璃小珠撞击微生物细胞使达到细胞的某种程度破碎，是一种常用的机械破碎方法，其原理是利用固体间的机械剪切力，适用于植物材料和细菌细胞的破碎研磨法常用的设备有细菌磨，高速珠磨机，胶质磨，高速组织捣碎机和匀浆器等。

珠磨是一种常用的机械破碎细胞的方法，利用玻璃小珠与细胞悬浮液一起快速搅拌由于研磨作用，使细胞获得破碎，常用的工业设备是高速珠磨机适用于绝大多数微生物细胞的破碎如：采用高速湿法珠磨分离纯化重组人肿瘤坏死因子时，菌体经间歇式珠磨机破碎3 min，玻璃珠直径为0.25-0.50 mm，装珠量为破碎室总体积的85%，搅拌转速1500 r/min，破碎液于4℃,15000 r/min离心15 min后去除细胞碎片本条件下，目标蛋白回收率可达90.3%，活性回收率为85.8%但与高压匀浆法相比，影响破碎率的操作参数较多，操作过程的优化设计较复杂如面包酵母菌破碎时，破碎速率与诸如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等许多操作参数有关提高搅拌速度，增加小珠装量，降低酵母悬浮液的浓度和通过磨机的循环速率均可增大破碎效率由于珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1％左右，破碎过程产生大量的热能因此，在设计操作时应。