康复新凝胶剂对小鼠创面组织修复的作用及相关机制探讨.docx

    康复新凝胶剂对小鼠创面组织修复的作用及相关机制探讨    薛尧 展冠军 马静[摘要]目的：观察康复新凝胶剂对小鼠皮肤创面损伤的作用，并探讨其可能的作用机制方法：60只C57BL/6J小鼠随机分成模型组、康复新凝胶剂组（凝胶剂组）、林可霉素利多卡因凝胶剂组（林可霉素組），每组20只，采用全层皮肤切除法在C57BL/6J小鼠背部制备伤口，伤口造模后开始按组对应给药10d;于治疗第3、7、10天拍照观察伤口图像并计算创面愈合率;酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中白细胞介素-6（IL-6）与转化生长因子-β（TGF-β）的含量;于治疗后第10天处死各组小鼠，苏木精-伊红染色法（HE）观察创面组织变化;免疫组化染色检测创面组织血管内皮生长因子（VEGF）、M1型巨噬细胞标志物（iNOS）与M2型巨噬细胞标志物（CD206）蛋白表达;荧光定量PCR（qRT-PCR）检测创面组织中IL-6、TGF-β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-10（IL-10）mRNA表达水平结果：与模型组比较，康复新凝胶剂组小鼠于治疗后第3、7、10天伤口愈合较为明显，创面愈合率显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）;血清中IL-6含量显著下降且TGF-β含量显著升高（P<0.05）。

治疗10d后，与模型组比较，康复新凝胶剂组小鼠创面炎性细胞浸润明显，新生致密肉芽组织，有大量新生毛细血管形成，同时VEGF阳性表达率显著增加（P<0.05），iNOS阳性细胞数显著减少而CD206阳性细胞数显著增加（P<0.05），且与林可霉素利多卡因凝胶剂作用等效结论：康复新凝胶剂能够促进小鼠伤口愈合，减轻伤口部位炎症反应，其机制可能与创面巨噬细胞表型转化有关[关键词]创面损伤;康复新凝胶剂;林可霉素利多卡因凝胶剂;巨噬细胞;炎症反应[]R622    [文献标志码]A    []1008-6455（2021）04-0110-05Study on the Effect and Related Mechanism of Kangfuxin Gel on the Repair of Mice Wound TissueXUE Yao，ZHAN Guan-jun，MA Jing[Department of Pharmacy，Nanjing Dachang Hospital（Jiangbei Campus of Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University），Nanjing 210048，Jiangsu，China]Abstract： Objective  To observe the effect of Kangfuxin Gel on skin wounds in mice and explore its possible mechanism. Methods  60 C57BL/6J mice were randomly divided into the model group， the Kangfuxin gel group （gel group） and the lincomycin lindocaine gel group （lincomycin group）， 20 mice in each group. Used full-thickness skin excision method to prepare wounds on the back of C57BL/6J mice. After wound modeling， start to administer drugs according to the group for 10 days. Taked pictures and observe wound images on the 3， 7 and 10 days of treatment and calculate the wound healing rate. Detectted the levels of interleukin-6 （IL-6） and transforming growth factor-β （TGF-β） in the blood by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mice of each group were sacrificed on the 10th day after treatment. Hematoxylin-Eosin staining method （HE） observes the changes of wound tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， M1 macrophage marker （iNOS） and M2 macrophage marker （CD206） in wound tissue. Fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the mRNA expression levels of IL-6， TGF-β， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-10 （IL-10） in wound tissues. Results  Compared with the model group， mice in the Kangfuxin gel group had more obvious wound healing on the 3， 7 and 10 days after treatment， the wound healing rate increased significantly， the differences were statistically significant （PKey words： wound injury; Kangfuxin gel; Lincomycin lidocaine gels; macrophage; inflammatory reaction皮肤持续暴露于外部极易受到各种创伤，皮肤受伤后会触发一系列复杂生理病理过程来进行创面愈合，主要涉及以下四个阶段：凝血，炎症，迁移-增殖和重塑，任何一个阶段功能出现障碍都会导致伤口愈合受阻[1-3]。

创面若不能有效、快速愈合，则会导致继发感染甚至引发死亡[4]，严重影响着患者的生活质量与健康，探究加速创面愈合并改善愈合质量的新策略对于患者来说至关重要巨噬细胞是源于血液系统中的单核细胞，也是先天性免疫的重要组成部分研究表明，巨噬细胞及其分泌的相关因子在创面愈合的所有阶段均发挥着至关重要的作用[5-7]巨噬细胞活化后可被分为两种不同的表型，即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞研究表明，在创面的炎症发生发展过程中，巨噬细胞的表型转化直接影响着创面愈合的速度与质量[8]康复新凝胶剂是由大蟾干燥虫体的乙醇提取物制成的外用制剂，其液体制剂具有激活创面免疫活性细胞、调节炎性反应以及快速促进伤面愈合的作用[9]本研究旨在观察康复新凝胶剂对小鼠皮肤创面的促愈合作用，通过对伤口部位进行组织学及分子生物学分析，探讨康复新凝胶剂促创面愈合的机制1  材料和方法1.1 实验动物与试剂：清洁级C57BL/6J雄性小鼠，6～8周龄，体质量（22±3）g，购自东南大学实验动物中心康复新凝胶剂参考罗诚等的方法[10]进行制备，林可霉素利多卡因凝胶剂（批号：160601）购自上海新亚药业闵行有限公司，ELISA试剂盒、HE染色试剂购自上海碧云天生物研究所，免疫组化染色试剂购自北京中杉金桥公司，Trizol 试剂、Prime ScriptTM RT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒购自日本Takara公司，大鼠单克隆抗VEGF、兔单克隆抗 iNOS与兔单克隆抗CD206购自美国Abcam公司，HRP标记山羊抗兔IgG购自武汉谷歌生物科技有限公司，其他试剂均用国产分析纯。

1.2 动物造模：C57BL/6J小鼠通过腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉后，进行消毒处理，在小鼠背面脊梁两侧用无菌手术刀切直径1.6cm大小的全层皮肤创面，深度达皮下深筋膜，切割后，无菌纱布压迫止血，用凡士林油纱布覆盖伤口，防止创面干燥，并使用医用胶布固定将小鼠独笼饲养，期间自由饮水与进食2d后小鼠出现精神萎靡，且背部创面有脓性分泌物，则表示造模成功1.3 动物分组与处理：将60只C57BL/6J小鼠随机分成3组，分别为模型组、康复新凝胶剂组（凝胶剂组）、林可霉素利多卡因凝胶剂组（林可霉素组），每组20只各组小鼠进行造模，造模成功后，生理盐水擦洗小鼠创面，凝胶剂组和林可霉素组小鼠创面分别予以0.1ml康复新凝胶剂、林可霉素利多卡因凝胶剂处理，模型小鼠创面贴敷生理盐水每天换药1次，直至处死1.4 创面愈合率测定：分别于治疗后第3、7、10天检测各组小鼠创面愈合情况，对小鼠的创面进行拍照，用Image-ProPlus软件进行测定分析，计算创面愈合率创面愈合率（%）=（原始创面总面积-未愈合创面面积）/原创面总面积×100%1.5 ELISA检测血清中IL-6与TGF-β的含量：分别于治疗后第3、7、10天各组小鼠心脏取血，血液在室温下静置30min，通过冷冻离心机中以3 500r/min离心15min，吸取上清。

按小鼠IL-6与TGF-β ELISA试剂盒说明书操作步骤，于酶标仪450nm处测定OD值，计算IL-6与TGF-β含量1.6 组织学观察：于治疗后第10天处死各组小鼠，以创面为中心，距创面边缘向外2mm切取组织将组织分成两半，一半放置于液氮后保存于-80℃，另一半以4%多聚甲醛固定，用于病理标本制作创面组织经4%多聚甲醛固定后，进行常规石蜡包埋，制成厚度为4μm的切片，常规脱蜡水化后，进行HE染色：苏木精染色5min，流水冲洗后，伊红染色3min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，自然风干，中性树胶封片，于光镜下观察组织中炎性细胞浸润、新生毛细血管量、肉芽组织生成情况1.7 免疫组化检测创面组织VEGF、iNOS与CD206表达：于治疗后第10天检测各组小鼠创面组织VEGF、iNOS与CD206的蛋白表达情况创面组织经4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片后，进行常规脱蜡水化放入抗原修复液中高温下进行修复，室温自然冷却后PBS冲洗，并滴加3% H2O2作用20min，PBS再次洗涤后，滴加稀释的大鼠单克隆抗VEGF（1：100）、兔单克隆抗iNOS（1：80）、兔单克隆抗CD206（1：200）为一抗，4℃下孵育过夜，次日PBS洗涤后，滴加对应的二抗工作液，在室温孵育60min后，PBS冲洗，滴加DAB显色3min，经苏木素复染2min，梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树脂封片，在光学顯微镜下观察并采集照片。

1.8 qRT-PCR检测创面组织中IL-6、TNF-α、IL-10与TGF-β mRNA表达：根据RNA提取试剂盒提取创面组织总RNA，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度利用反转录试剂盒Prime ScriptTM RT reagent Kit将提取的RNA 反转录为cDNA，qRT-PCR法检测创面组织中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β mRNA的表达情况，根据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书进行操作，以GAPDH为内参反应条件为95℃ 30s（1个循环。