糖芯片的检测及应用.pdf

糖芯片的检测及应用黄 河 贾红英 侯 信3(天津大学材料科学与工程学院 天津 300072)黄 河 男,24岁,硕士生从事生物材料的研究3 联系人E2mail : houxin @国家自然科学基金项目(50403017)资助2008203226收稿,2008210218接受摘 要 糖芯片技术具有样品少、 通量高和特异性强等优点,是一种糖组学研究的新的技术平台和强大的分析工具,已经广泛用于糖和蛋白质的特异性作用、 酶活性和抑制剂、 病毒入侵机理、 细菌检测和免疫反应等方面的研究本文简要介绍了糖芯片的原理、 制备和信号的检测技术(荧光标记法、 质谱法、SPR法等) ,分析了糖芯片在各个领域的应用及其发展前景关键词 糖芯片 糖生物学 荧光标记 免疫反应Detection and Application of Carbohydrate MicroarraysHuang He , Jia Hongying , Hou Xin3(School of Materials Science and Engineering , Tianjin University , Tianjin 300072)Abstract The biological significance of glycans in the post2genomic era requires the development of new technologiesto enable functional studies of carbohydrates in a high2throughput manner. Recently , carbohydrate microarrays , as a newkind of promising biological2chip following the gene microarray and protein microarray have been exploited as an advancedtechnologyfor this purpose. It will highly promote the development of glycobiology due to the advantages of carbohydratemicroarray such as less dosage of samples , higher specificity and high2throughput. In this paper , progress in the detectionmethods of hybridizes information of carbohydrate microarrays and their potential applications for functional glycomics areintroduced. The future trend of carbohydrate microarray is also discussed.Keywords Carbohydrate microarray , G lycobiology , Fluorescent labeling , Immune response糖芯片是在基因芯片和蛋白芯片的基础上诞生的,其基本原理与基因芯片和蛋白芯片相似,都是基 于物质之间的特异性作用[1]。

它是将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上,进而对蛋白质、 糖蛋白等待测样品进行测试、 分析的一类分析方法[2]由于生物体细胞表面 被各种形式的多糖或糖复合物所覆盖,这些糖基复合物不仅在细胞识别、 细胞粘附、 细胞间信号传导等方面具有重要的作用,而且在细胞病变、 病原感染等过程中亦有重要意义[2],因此糖芯片的出现为糖生物学、 免疫学和疾病诊断的研究提供了一种强有力的分析手段,在糖蛋白鉴定、 糖2蛋白特异性结合的分析、 受体糖结合位点的鉴定、 免疫学研究、 筛选药物等许多领域具有良好的应用前景[3]随着糖芯片技术的不断发展,与此相适应的信号检测方法,如荧光标记法、 化学发光法、 质谱法和表面等离子共振(SPR)光谱法等检测手段在糖芯片技术中的应用也得到了迅速的发展1 糖芯片的制备糖芯片技术是由Fukui等[4]首先报道的,他们以硝酸纤维素膜为基板制成糖芯片糖芯片的制备一般包括3个过程:(1)把糖或糖基复合物连接到基板上制成糖探针; (2)把靶样(蛋白质、RNA或细胞) 和糖探针相结合;(3)检测结合的信号[5]其中,糖探针的制备有原位合成和直接点样两种方法,原位合成一般是通过光引导的方法直接在化学修饰过的基板上进行合成,而点样法则是先合成然后再用点样 仪将其点样到基板上[6]。

在糖芯片制备中,糖在基板表面的固定是非常重要的一步目前有3种方法·104·http :Π Πwww. hxtb.org 化学通报 2009年 第5期可用来固定糖类:(1)将未修饰的糖以非共价、 无特异性作用位点的方式固定到未进行表面处理的基板 上,但由于该方法仅适于分子量较大的糖或糖复合物,且非共价结合程度不好控制,导致后面荧光标记 和冲洗时很容易丢失数据,因而具有一定的局限性;(2)将化学修饰过的糖以共价、 作用位点特异的方式 固定于未进行表面处理的基板上;(3)将化学修饰过的糖以共价、 作用位点特异的方式固定于表面处理 过的基质上[3]2 糖芯片反应信号的检测糖芯片反应信号的检测是获取固定在芯片上探针信息变化的过程,是糖芯片相关技术的一个重要 组成部分从检测手段上,可以将糖芯片的检测分为有标记和无标记两类,有标记法通常需要对探针或 样品分子进行标记,以便利用光、 电、 磁等性质检测,常见的标记有荧光标记、 电化学标记、 同位素标记等,标记法可以提高检测的灵敏度,但是高成本和复杂的操作程序,也可能影响自然的识别过程无标 记法是直接观察待测分子发生反应前后本身性质,如重量、 介电性质、 光学性质等的改变,但是需要如质 谱、 表面等离子体共振谱仪等昂贵的仪器设备,检测成本较高[7]。

图1 荧光标记检测法的操作示意图Fig. 1 Scheme of the of fluorescent labeling detection211 有标记物的检测方法21111 同位素标记法 同位素标记是一种灵敏度高、 应用广泛的检测手段,一般用于阵列密度较小的 芯片,所需要的均为实验室常规使用设备,易于展开相关工作[8]但与荧光标记法等相比,其在信号检 测时一些反应信号强的点阵容易产生光晕而干扰周围信号的分析,所以在芯片检测分析时用得不多21112 荧光检测法 荧光检测法是将荧光染料(如Cy3、Cy5等)标记的靶样与糖探针反应,再用冲洗液冲洗已经发生作用的芯片,除去多余荧光素的干扰,然后用CCD照相技术及激光扫描系统等对结合到 芯片上的靶样所发出的特定信号进行检测,它具有高通量、 高分辨、 定位功能强和操作稳定性好等优点, 是糖芯片反应信号检测技术中应用最广泛的一种当糖探针与靶样完全反应时产生的信号强度最强, 不完全反应时荧光信号较弱,不能发生特异反应则检测不到或只能检测到芯片原有的荧光信号[9],所以 通过采集各反应点的荧光位置、 荧光强度,再经过相关软件对图象进行分析,就可获得有关生物信息[10],其基本操作流程如图1所示[11]。

Krull等[12]以共价方式固定在石英光纤表面的甘露糖为探针,与 溶液中的凝集素杂交,再与荧光嵌入染料溴乙啶(EB)反应,根据荧光强度与溶液中发生反应靶样的量 的正比关系进行分析,检测出了待测凝集素;但是,由于只要有荧光标记的物质结合到探针阵列上都会 发出阳性信号,且糖含有大量的羟基,与待测靶样作用的位点比较多,难以判断发生的反应是否为探针 和靶样的配对或是否为正确的配对,所以检测灵敏度较低为此,需要对荧光标记和分析过程进行改进多重颜色荧光素标记比照实验[13]是比较常用的一种改进方法Kuo等[14]将待测靶样刀豆凝集素Con A用Cy5荧光素标记,对照样木菠 萝凝集素jacalin用Cy3荧光素标记,然 后把待测的靶样和对照样都同时和同 一甘露糖芯片进行作用,用共焦扫描荧 光探测器测定,发出红光的点样是待测 靶样,发出绿光是对照样,发出黄光则 是待测靶样和对照样共同作用的效果, 若点样是黑色的则说明待测靶样和对 照样都没有和该探针发生作用结果 发现,甘露糖与Con A存在特异性结 合,而与jacalin没有反应 212 无标记物的检测法21211 质谱法 由于标记物可能会改 变待测物的结构和活性,所以,用标记 法检测时,误差较大且灵敏度较低[15]。

·204·化学通报 2009年 第5期 http :Π Πwww. hxtb.org质谱法是无标记的方法,可避免标记物带来的误差,具有较高的灵敏度到目前为止,质谱仍是糖生物 学家应用最为广泛的研究糖链结构的工具其中快原子轰击质谱(fast atom bombardment massspectrometry ,FAB2MS)、 电喷雾质谱(electrospray mass spectrometry ,ES2MS)、 基质辅助激光解吸离子化飞行 质谱(matrix2assisted laser desorption ionization time2of2flight mass spectrometry ,MALDI2TOF2MS)是目前在糖链 结构测定方面广泛采用的3种质谱,它们可以直接对样品进行离子化和解析作用以获得信息[16]Zhang等[17]通过对一系列的N2连接寡糖和O2连接寡糖的检测,发现应用这种技术产生的糖链片段非常少,可 以完整地分析其结构,而且具有很高的敏感度质谱法测定糖芯片的另一个优点是可以和其他的分离 设备(如蛋白质分离设备、 高效液相色谱HPLC、 毛细管电泳CE等)联用,经HPLC和CE分离得到的糖蛋 白或寡糖可以直接进入质谱仪进行结构分析,从而避免了样品转运过程中的污染和损失,提高了分析效 率和准确度。

Heintz等[18]先用液相色谱仪分离由胰蛋白酶催化合成的多肽链,然后把各个化合物分别和糖芯片进行相互作用,用质谱仪分析,鉴定出了磷酸蛋白再有,质谱法不仅能够测定糖链的结构,而 且可以测定糖链在糖复合物中的定位Harazono等[19]先将人类载脂蛋白B100用不同的蛋白酶水解得 到不同大小的肽段,然后用液相色谱分离所得到的肽段,再将分离后的肽段直接放入质谱仪进行测定, 获得了载脂蛋白Bl00的糖基化位点信息图2 SPR检测的工作原理Fig. 2 Scheme of the SPR detection21212 表面等离子共振光谱法(SPR) SPR检测的突出优点是待测物无需标记,能适用于混浊、 不透明或者有色溶 液,且能实时、 连续监测反应动态过程[20]SPR光谱法作为 无标记法能快速对抗体2抗原以及糖和蛋白之间的特异性 反应进行检测上世纪90年代,糖生物学家就将这项技术 用于监测凝集素和固定化糖在玻片表面的相互作用[21]SPR技术是利用物理光学的原理,在研究两分子相互作用 时,将一种分子固定在传感片表面,而含有另一种分子的溶 液流过其表面,两种分子的结合会使传感片表面的折射率 改变,从而导致表面等离子共振条件的变化。

通过检测共 振角或共振波长的变化来检测待测分子的成份、 浓度以及参与化学反应的特性[22],其检测原理如图2所示[23]Ratner等[24]将修饰后的一系列高甘露糖固定制成糖芯片,研究其与蓝藻抗病毒蛋白2N(cyanovirin2N ,CVN)之间的相互作用,结果发现,用SPR检测的结果 与用荧光素标记法检测的结果完全一致SPR在糖芯片中的应用为糖组学研究提供了。