环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体.pdf

农业生物技术学报，2010年，第18卷，第4期，第822010，8，， 二 技术改进 介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体 郭盼盼黄书林张跃伟付萍李旭妮李佳禾吴文学 中国农业大学动物医学院，北京100193 通讯作者，要利用环介导等温扩增(1法建立了猪肺炎支原体 (快速检测方法该方法以猪肺炎支原体保守性基因16S 6条特异引物，在63℃等温条件下，30 果显示，敏感性 实验中，感性高于异性实验 中，对127个临床鼻拭子样本的检测中，结果是所有样本都为阳性，而明本研究所建立的方法，对临床样本的检测的 敏感度高于常规的速、高效、敏感、特异、经济的特点，在研究机构以及 基层实验室、现场监测的广泛使用具有一定的潜力 关键词猪肺炎支原体(环介导等温扩增技术(u i i u 00193，0．3969~．674—7968．201O．04．031 a of of to 6S is a be 0 3~C．CR，hi【gh he of to 0 by a 0一of CR n CR to CR 27 or CR 1 6 he CR of is to it in in 支原体肺炎(of 又称猪气喘病，国外又被称为猪地方 0．3969／j．674—7968．2010．04．031 基金项目：本研究由农业部重点项目(008．助 收稿日期：2009—04．03 接受日期：2009．05．21 性肺炎(由猪肺炎支原体 (起猪以咳嗽和 824 ， 。

A 图2 胶电泳图(A)和 胶电泳图(B) M：TN：阴性对照；1～16：分别 为猪肺炎支原体168株、济南株(株、猪胸膜 肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、支 气管败血性博德特氏菌、葡萄球菌、猪链球菌、布氏杆菌、猪繁 殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒 by ％fA)CR by ％) M：T．N：NA；l～16：，， J，A RV，镁离子结合，能产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉 淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增 产物中添加荧光染料通过颜色变化来判定结果 随着分子生物学的发展和对支原体基因组学的 研究不断深入，各种994)针对l 6S 测限是1000 对16S 999)根据16S 物和巢式规 相当于8．3巢式相当于80个拷贝，并通过检测一组猪鼻拭子标本中 的猪肺炎支原体现．6％(2／55)，而巢式％ (30／55)006)针对16S g 16S 应的集保守性与变异性于一身，是 目前应用最广的分子微生物学检测的靶基因，编码 16S 高度的保守性本实验根据支原体232株的保守性基因16S ，成功设计了6条引物此段序列经分析，与 332)的同源性为l 00％。

实验表明，该方法检测猪肺 炎支原体的灵敏性非常高，目前常用的仅能检测到1明限高于特异性实验中 其它病原没有 交叉反应在临床样本的检测中，高于本研究方法在灵敏度、特异性、高效性和操作性 等方面均达到甚至优于传统的方法的 特点和优势使之在基层实验室、现场监测以及研究 机构的广泛使用具有一定的潜力随着该技术的不 断完善，该方法将作为分子生物学的一种快速检测 技术广泛应用于各种病原体的检测和疾病的快速诊 断，为及时控制传染病和临床快速诊断疾病提供技 术支撑 3材料与方法 3．1菌株 1型猪胸膜肺炎放线杆菌 支气 管败血性博德特氏菌(5型 霍乱沙门氏菌(猪肺炎支原 体济南株(株(购自中国兽药监察所，布氏杆菌 (吴清民老师惠赠，葡萄球菌 (和猪链球菌(t 盖新娜老师惠赠，猪肺炎支原体(68株、繁殖与呼吸综合症病 毒标准株(猪细小病毒( 伪狂犬病毒(61株、猪瘟病毒((猪瘟兔化弱毒株，由本实验室保存 3．2方法 3．2．1模板用剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取菌液和鼻 hyopne。