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基因定点突变全攻略.docx

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  • 卖家[上传人]:hs****ma
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  • 上传时间:2022-11-03
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    • 基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段(可以就是基因组, 也可以就是质粒)中引入所需变化(通常就是表征有利方向得变化),包括碱基得添加、删除、 点突变等定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征,就是基因研 究工作中一种非常有用得手段体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具,也就是实验 室中改造/优化基因常用得手段蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研 究得重点之一对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得 氨基酸序列与蛋白质结构,对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功 能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域而利用定点突变技术改造基因:比如野生型得绿色荧 光蛋白(wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定 氨基酸定点改造,现在得GFP能在可见光得波长范围被激发(吸收区红移),而且发光强度比 原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。

      定点突变技术得潜在应用领 域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动 子或者DNA作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构,以 及药物研发、基因治疗等等方面.通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行 了.三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1) 通常引物长度为2 5~45 bp,我们建议引物长度为30~35 bp一般都就是以要突 变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为11—12 bp若两边引物太短了, 很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要1 1T2个bp才能与模板搭上,而这种突变P CR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补 得引物2) 如果设定得引物长度为3 0 b p ,接下来需要计算引物得Tm值,瞧就是否达到78°C (GC含量应大于40%)3) 如果Tm值低于7 8C,则适当改变引物得长度以使其Tm值达到7 8C (GC含量应 大于4 0%)。

      4) 设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置.(5)最好使用经过纯化得引物Tm值计算公式:Tm=0、41X(% of GC) - 675/L+81、5注:L:引物碱基数;% of GC :引物GC含量.四、引物设计实例以GC G-ACG为例:5'—CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3'(1) 首先设计30 bp长得上下游引物,并将A (T)设计在引物得中央位置.Primer #1: 5'—CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC—3'Primer #2: 5'—GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG—3'(2) 引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=7 5、5 (Tm=0、4 1 X40-675/30+8 1、5)通过计算可以瞧出其Tm低于78°C,这样得引物就是不合适得,所以必须调整引物长度.(3) 重新调整引物长度.Primer #1: 5' -CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 'Primer #2: 5'—CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物得GC含量为45、7%,L值为35,将这两 个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80、952(Tm=0、41X4 7、5—67 5 / 3 5+8 1、5), 这样得引物就可以用于突变实验了.五、 突变所用聚合酶及Buffer引物与质粒都准备好后,当然就就是做PCR喽,不过对于PCR得酶与buffer,不能 用平时得,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buff er或扩增长片段得b uffer,另外,要用保真性能较好得PFU酶来扩增,防止引进新得突 变。

      除了使用基因定点突变试剂盒,如Stra tagene与塞百盛得试剂盒,但价格昂贵可以 使用高保真得聚合酶,如博大泰克得金牌快速taq酶、Takara得PrimeSTARTMHS DN A pol ymeras e六、 如何去掉PCR产物最简单得方法就就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用得模板 一般都就是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来(除非您 用得就是甲基化缺陷型得菌株),而PCR产物都就是没有甲基化得,所以DpnI酶能够特异 性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些 菌株一定不能就是甲基化缺陷株.DpnI处理得时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处 理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.七、 如何拿到质粒直接把通过DpnI处理得PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质 粒,拿去测序,验证突变结果八、 图示PCR zmpl HindNot t/nndonindStep 1. Inducing mutatlo r q ・ PCR 啤-Using Miutd-dircel™I 5tsp2. SsldctionH ・龙1用Mutarvm$f^p J-. Tran^nnnqti^rH ■Using eempatent ecj [Nick re cove ring;九、定点突变操作步骤[A]诱导突变基因(PCR反应)以待突变得质粒为模板,用设计得引物及Mu ta—direc t™酶进行PCR扩增反应,诱导目得基因突变.1、 设计点突变引物.[注]参考引物设计指导2、准备模板质粒DN A[注]用dam,型菌株(例如DH5a菌株)作为宿主菌。

      在end +型菌株中常有克隆数低得现象, 但就是对突变效率没有影响提取质粒DNA时我们建议您使用本公司得质粒提纯试剂盒3、10XReac tion Buffer5ulpUC18 control pl asm i d(10ng/ul ,total 2 Ong)2ulC o ntr o l prime r mix( 2 0pmol/ul)2uldNTP mixture (each 2.5mM)2uldH 023 8ulMut a -dir ect™ Enzyme1ul[选项]对照反应体系(5 0卩l反应体系)样品反应体系(50ul反应体系)4、lOXReaction Buffe r5ulSample plasmid(10ng/yl, total20n g)2u1Sam p le primer (F)( 1 0pmo 1 /ul)1ulSample prime r (R) (10pmol/u1)1u1dNTP mixt ure(each 25mM)2u1dH O238ulMuta -direc t™ Enzyme1ul5、PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件Cycle sTemperat u reReac tion Time1 c ycle9 5C3 0sec15cycle95C30se c55C1m i n72C1mi n per pl a smid K b6、 PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融)。

      [注]按下列提供得PCR条件进行扩增,控制PCR循环数注意当突变点位点超过4个时 会发生突变率降低得现象Mut a tionC ycle s1~2Nucle ot ide15 c ycles3Nu c le oti de s1 8 cycle s[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mu t azyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.1、 准备PCR反应产物2、 加入 lul(10U/ul)Mutazyme™酶3 7°C温育 1 小时.[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全得现象因此我们建 议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作.如果突变率低,可以适当延长反应时间或 增加Muta zyme™酶用量[C] 转化反应完毕后在质粒DNA 上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E、coli中时请选择dant 型菌株,例如DH5a1、 将10ul样品加到50U1感受态细胞里,然后放置在冰上3 0分钟2、 接下来可以参照一般得转化步骤进行.序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析先讲最简单得一个点得定点突变技术,其它较长片段得突变,删除,插入技术以后会慢慢 奉上:在做实验之前,我们首先要搞清楚实验得目得与实验得原理。

      金 实验得目得应该 比较明确吧:就就是要把自己得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基一般情况下我们会 有几种可能使我们需要这样去做:第一:我们吊出来得基因有点突变,相信这可能就是大家经常会遇到得问题基因好不容易 吊出来,并装进了自己得载体,却发现有一两个碱基跟自己得预期序列或所有得公共数据库 不匹配,然后暴昏大家实验室里面还就是用Ta q酶为主吧,Pfu这样得高保真酶大家应该用得不多 吧,Taq酶得优点与缺点都很明显:优点就就是扩增效能强,缺点就就是保真性差其错配机 率就是比较高得,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果就是20 0 0bp 得基因,如果扩四五十个循环得话,很大机率会出现点突变,当然这也跟具体PCR体系里得 Buffer有很大关系,详细情况这里就不讨论了第二:要研究基因得功能,在基因上自己选定位置更换碱基得保守序列,或者改造成不同得亚 型,总之就就是要人工改造碱基序列符合自己得实验需要,相信这也就是那些研究基因得人 经常得一种思路吧对于第一种情况:我们首先要分析出现碱基不匹配得位置就是不就是重要得位置,如果 不就是很重要,大可不必管它,比如说就是三联密码子得最后一位,碱基得改变并没有引起相 应氨基酸得改变,那么一般情况下也可以不去理它。

      另外在NCBI上人类得基因得版本一 直在变化,也就就是说同一个基因有不同得版本,或者称不同得亚型,其碱基序列有些许得差 异,只要自己克隆出来得碱基序列与其中一个相匹配,一般也就可以不做定点突变了如果 有时间没钱,那干脆重新PCR然后再克隆进自己得载体了,不过最好换个保真性好一点得酶 如PFU,或者PCR循环数低一点,不过这些东西有时候也得靠运气啦.实在不行得话再来做定 点突变• a对于第二种情况:这种情况下一般也就只能做定点突变了.接下来开始聊一聊定点突变得原理吧,那个Strat agene试剂盒!上面有一。

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