人胚肺间充质干细胞对损伤肺组织的修复作用.doc

KKME---专业医学搜索引擎 钱东华 钱 明 1 彭丽萍 作者单位：(吉林大学第一医院呼吸科，吉林 长春 130021)【摘要】 目的 研究人胚肺间充质干细胞(MSCs)对损伤肺组织的修复作用方法 通过动物体内实验和细胞体外培养实验，观察人 MSCs 对肺上皮细胞的生长调控结果 人胚肺 MSCs 能有效调控肺泡上皮的生长结论 人胚肺 MSCs 及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗 COPD、病毒性肺炎造成的肺损伤提供新的生物治疗方法关键词】 人;胚胎肺;间充质干细胞;损伤肺组织人胚肺间充质干细胞(MSCs)可在体外扩增培养，可传至 17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变，处于 G0/G1 期的细胞多，具有典型的干细胞增殖特点，其免疫表型与骨髓来源的 MSC 相似〔1〕 ，能够被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种组织细胞,为肺损伤的治疗提出了一个新的思路本研究通过动物体内实验和细胞体外培养实验，观察人胚肺 MSCs 对肺上皮细胞的生长调控，证实在肺脏损伤后，人胚肺 MSCs 及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗慢性阻塞性肺病(COPD)、病毒性肺炎等造成的肺损伤提供新的生物治疗方法。

1 材料与方法1.1 MSC 调控肺上皮细胞生长实验 动物体内实验：选用无KKME---专业医学搜索引擎 NOD/SCID 小鼠并制备呼吸道上皮、肺泡上皮损伤模型NOD/SCID 小鼠经过 137 铯照射 300 cGy 分别输入荧光燃料标记的人胚肺 MSCs、人骨髓 MSCs，定期通过肺组织切片和 PCR检测外源基因，观察细胞移植和生长情况经尾静脉输入胎肺来源的 PKH26 荧光染料染色的 MSCs 1×106 和 NOD/SCID 鼠自身的骨髓 1×107，2 个月后小鼠断颈处死，肺脏组织冰冻切片，荧光显微镜观察 PKH26 荧光阳性的细胞分布肺脏组织提取基因组DNA，PCR 测定人源性特异基因 Amelogenin,上游引物：5′ACCTCATCCTGGCCACCCTGC3′,下游引物5′AGGCTTGAGGCCAACCATCAG3′PCR 条件是 96℃变性 5 min,94℃变性 1 min,60℃退火 1 min,70℃延伸 1 min,共 30 个循环，最后 70℃延伸 10 min分别输入两种干细胞和条件培养液给肺损伤模型鼠，观察肺上皮损伤修复速度和程度1.2 体外细胞培养实验1.2.1 建立人胚肺 MSC 滋养层细胞培养体系(方法同上)。

1.2.2 人胚肺 MSC 支持成人呼吸道上皮细胞生长的实验1.2.2.1 主要试剂 蛋白酶型内皮细胞生长支持物(ECGS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素(INS)、转铁蛋白(TF)、甲状腺素(T3)、氢化可的松(HC)、抗角蛋白抗体、人胎盘胶原(HPC)均为 Sigma 产品，LSAB 免疫组化试剂盒为 Dako 产品，MEM、DMEM/F12 培养基、胎牛血清 FCS 为 Gibco 产品，L谷胺酰胺为 Merck 产品，余为国产分析纯KKME---专业医学搜索引擎 培养器皿 24 孔板为 Coring 产品，套皿(MillicellCMΦ12 mm)为 Millpore 产品，套皿用 HPC 按 20 Μg/cm2 涂膜置室温 18 h 弃去多余 HPC，室温干燥，临用前用 PBS洗涤 24 孔板涂膜同上1.2.2.3 培养基配制 在 DEMEM/F12 培养基中加入 10 Μg/ml INS、0.4 Μg/ml HC、5 Μg/ml TF、20 ng/ml T3、25 ng/ml ECGS、1 mmol/L 谷胺酰胺、100 IU/ml 青霉素、50 Μg/ml 链霉素为无血清培养基。

1.2.2.4 气管上皮细胞分离和培养 新鲜气管标本取自意外死亡的健康成人，由本院提供无菌条件下，用冰冷 PBS 冲洗纵向切开气管，机械剥离黏膜层，剪成 23 mm 长小片同上 PBS 冲洗置于含蛋白酶 0.5 mg/ml PBS 中 4℃过夜消化用漩涡震荡器剧烈震荡消化后的黏膜碎片 10 余秒，吸管轻轻吹打数分钟，加 FCS 至终浓度为 2.5 终止酶反应，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清 MEM 洗涤细胞 2 次用含 5FCS 的 DMEM/F12 培养基配置成细胞悬液，台盼蓝拒染色检测活细胞数，按 2.5×109 个活细胞/cm2 加入套皿，5% CO237℃培养 24 h 后换为无血清培养基，隔日换底层培养液一次设置常规 24 孔板无血清培养为对照1.2.2.5 人胚肺 MSCs 对成人气道平滑肌细胞生长的影响 将前述获得的人胚肺 MSCs 贴壁细胞用胰酶消化，收集所有贴壁细胞，1 000r/min 离心，洗涤 2 次后，计数，取 10 ml 同时加入 0.8%甲纤素，15%MCM，30%人 AB 血清及适量 IMDM，以 1×106 细胞KKME---专业医学搜索引擎 24 孔板平滑肌的培养基，未加入人胚肺 MSC 的气道上皮细胞为对照组，放入 37℃5%CO2 饱和湿度培养箱内，共同培养 10～12 d，40～50 个细胞为 1 个集落，观察气道平滑肌的生长情况，测定人胚肺间充质干细胞对气道平滑肌生长情况的影响(以细胞集落数计算)。

1.3 滋养层系统支持中晚期胎儿人胚肺上皮细胞生长的实验1.3.1 滋养层系统的建立方法同上1.3.2 胚胎肺上皮细胞体外培养 采用组织块贴壁培养法，对药物引产的 3～5 个月胎龄胎儿肺组织进行原代培养，于 5% CO2，37℃培养箱内培养，待细胞生长汇合后，采用 0.05%胰酶、乙二胺四乙酸钠消化进行传代培养;培养基为含 10%胎牛血清和青霉素、链霉素的 RPM1640(Gibco/BRL)细胞按 1∶3 比例稀释，2～3 d 细胞生长至饱和进行常规传代培养1.3.3 人胚肺 MSC 对胚胎肺上皮细胞生长的影响 将前述获得的人胚肺间充质贴壁细胞用胰酶消化，收集所有贴壁细胞，1 000 r/min 离心，洗涤 2 次后，计数，取 10 ml 同时加入 0.8%甲纤素，15%MCM，30%人 AB 血清及适量 IMDM，以 1×106 细胞加入 24孔平板平滑肌的培养基，未加入人胚肺 MSCs 的气道上皮细胞为对照组，放入 37℃ 5% CO2 饱和适度培养箱内，共同培养 10～12 d，40～50 个细胞为 1 个细胞集落，观察气道平滑肌的生长情况，测定人胚肺 MSC 对气道平滑肌生长情况的影响(以细胞集落计算)。

KKME---专业医学搜索引擎 MSC 条件培养液对成人呼吸道上皮生长的影响 收集各代的人胚肺 MSCs 上清液，低温离心 10 min，3 000 r/min，取上清即得 MSC 培养液(FCM),用同样方法 24 孔板培养成人气道上皮细胞，将每孔中的人胚肺 MSC 以 FCM 代替，其余培养条件相同，40～50 个细胞为 1 个集落，集落生长情况见表 11.5 统计学分析 组间比较采用 t 检验，计量资料采用 x±s表示表 1 人胚肺 MSC 对成人气道上皮细胞及胚胎肺上皮细胞的影2 结 果2.1 动物体内实验结果 荧光显微镜下可见：输入人胚肺MSC 和人骨髓 MSC 的鼠肺内可见，PKH26 阳性的细胞散在分布，PCR 测定对照组(未经输入细胞的 NOD/CUID 鼠为阳性)、实验组Amelogenin 基因阳性见图 1表明在肺脏损伤后，人胚肺来源的MSC 可以在肺脏内分布，并长期定植，而人骨髓 MSC 同样可以定植见图 1图 1 Amelogenin PCR 结果及 NOD/CUID 鼠肺脏荧光照片图 2 气管上皮细胞体外培养的形态(×40)2.2 体外细胞培养实验结果 人胚胎间 MSC 对气道平滑肌生长情况的影响 套皿接种气管上皮细胞 20 h 后，贴壁率约为 80%，细胞体积较前增大，并进入分裂组，68 h 后细胞增殖旺盛，呈现重叠生长，上层为较大的圆形细胞，下层为较小的圆形细胞。

见图 2A比较套皿内气液界面培养的气管上皮细胞，发现采用无血清培养基与含 5%FCS 的培养基，KKME---专业医学搜索引擎 72 h 前两者细胞增殖无明显差异;72 h 后，含 5%FSC 的培养基中细胞增长明显变缓在常规 24 孔板对照中，无血清培养的气管上皮细胞呈单层生长，为多角形，相嵌状，见图 2B人胚肺 MSC 与气道上皮细胞共同培养 10～12 d 后，可见上皮细胞呈集落生长，而无人胚肺 MSC 则不形成集落，而只以散在的细胞存在，见图 3图 3 MSC 对气道上皮细胞生长的影响(×40)图 4 MSC 对人胚肺上皮细胞生长的影响(×40)2.3 滋养层系统支持中晚期胎儿人胚肺上皮细胞生长的实验结果 HLEC 细胞成岛样片状生长，细胞呈多边形，细胞间连接紧密，排列规则，单层生长，形态符合正常人肺上皮细胞特点细胞生长特性稳定，如 35代细胞在 48 h 的代龄为 16.1 h，65 代细胞的代龄为 15.4 h，非常接近该细胞目前在体外已连续传代 112 代，细胞形态、生长特性基本稳定，Β半乳糖苷酶染色阳性的细胞在早代数(35 代)和 100 代左右的 HLEC 细胞都只是偶尔可见，占总细胞的百分数接近零，未见阳性细胞随传代次数的增加而升高，无衰老迹象，说明该细胞可能已获得永生性。

人胚肺 MSC 与气道细胞共同培养 10～12 d，可见上皮细胞呈集落生长，细胞数明显增多，而无人胚肺 MSC 则集落数明显减少，见图 43 讨 论目前 COPD、病毒性肺炎等呼吸系统疾病造成肺损害的发生机制还不十分清楚,故现阶段仍无有效的治疗方法近年来,干细胞的研究引起了人们的极大关注,而成体干细胞的可塑性研究是干细胞KKME---专业医学搜索引擎 在不同诱导条件下具有向心肌细胞、肝细胞、神经元及肺泡上皮细胞等分化的多项潜能〔2～4〕 在胎儿肺组织中含有大量的 MSC,在出生后的小鼠肺组织也存在 MSC〔5〕 在成人支气管组织、支气管肺泡灌洗液标本中也分离出了肺内源性 MSC〔6〕 上述研究表明,在近端和远端不同部位的肺组织,都存在有 MSC肺MSC 具有与骨髓 MSC 相似的细胞表型和分化功能,在体外可大量扩增,可能成为用于治疗肺疾病的种子细胞本研究选择人胚肺 MSC，充分发掘其高度增殖和分化能力，并利用其胎儿组织相关抗原表达较弱，排斥反应轻的优点，使之更适合临床应用选择成人的骨髓 MSC 与胚肺 MSC 比较，为进行自体移植治疗奠定实验基础目前人们在很多组织中，如造血、神经、表皮、腺体等发现相应的促进生长、分化、成熟的细胞因子〔7〕 ，但尚未发现直接促进肺组织呼吸道黏膜上皮、肺泡上皮细胞生长成熟的细胞因子。

本研究通过观察胚肺 MSC 培养液对损伤肺组织的修复作用，证实人胚肺 MSC 能有效调控肺泡上皮的生长，人胚肺MSC 及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗 COPD、病毒性肺炎造成的肺损伤提供新的生物治疗方法由于肺部结构的复杂性,干细胞的应用研究进展落后于其他器官对肺组织损伤修复有关的干细胞研究有助于推动以细胞治疗为基础的肺损伤治疗新方法的发展参考文献】KKME---专业医学搜索引擎 Jiang Y，Jahagirdar 。