志贺氏菌检测.doc

志贺氏菌检测1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1.1 恒温培养箱：36℃±1℃；1.2 冰箱：2℃～5℃；1.3 膜过滤系统；1.4 厌氧培养装置：41.5℃±1℃；1.5 电子天平：感量0.1g；1.6 显微镜：10×～100×；1.7 均质器；1.8 振荡器；1.9 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头；1.10 无菌均质杯或无菌均质袋：容量500ml；1.11 无菌培养皿：直径90mm；1.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸；1.13 全自动微生物生化鉴定系统2 培养基和试剂3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录中13.2 麦康凯（MAC）琼脂：见附录中23.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录中33.4 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中43.5 营养琼脂斜面：见附录中53.6 半固体琼脂：见附录中63.7 葡萄糖铵培养基：见附录中73.8 尿素琼脂：见附录中83.9 β-半乳糖苷酶培养基：见附录中93.10 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录中103.11 糖发酵管：见附录中11。

3.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录中123.13 粘液酸盐培养基：见附录中133.14 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中143.15 志贺氏菌属诊断血清3.16 生化鉴定试剂盒4 操作步骤4.1 增菌以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可于41.5℃±１℃，厌氧培养16h～20h4.2 分离取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板志贺氏菌的菌落特征MAC琼脂无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐XLD琼脂粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐4.3 初步生化试验4.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。

4.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型4.4 生化试验及附加生化试验4.4.1 生化试验用4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性；宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型，鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果另外由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属志贺氏菌属生化特性见表2表2 志贺氏菌属四个群的生化特征生化反应A群：痢疾志贺氏菌B群：福氏志贺氏菌C群：鲍氏志贺氏菌D群：宋内氏志贺氏菌β-半乳糖苷酶－a－－a+尿素－－－－赖氨酸脱羧酶－－－－鸟氨酸脱羧酶－－－b+水样苷－－－－七叶苷－－－－靛基质－/+（+）－/+－甘露醇－+c++棉子糖－+－+甘油（+）－（+）d注：+表示阳性；－表示阴性；－/+表示多数阴性；+/－表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d表示有不同生化型。

a 痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性b 鲍氏13型为鸟氨酸阳性c 福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种4.4.2 附加生化实验由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养24h～48h)志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3表3 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别生化反应A群：痢疾志贺氏菌B群：福氏志贺氏菌C群：鲍氏志贺氏菌D群：宋内氏志贺氏菌大肠埃希氏菌A-D菌葡萄糖胺－－－－++西蒙氏柠檬酸盐－－－－dd粘液酸盐－－－d+d注1：+表示阳性；－表示阴性；d表示有不同生化型注2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性4.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据4.3.2的初步判断结果，用4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

4.5 血清学鉴定4.5.1 抗原的准备志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原注1：一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水做成浓菌液，100℃煮沸15min～60min去除K抗原后再检查注2：D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝宋内氏志贺氏菌没有K抗原4.5.2 凝集反应在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按4.5.1 注1进行试验。

附录 培养基和试剂1 志贺氏菌增菌汤-新生霉素（Shigella broth）1.1 志贺氏菌增菌肉汤1.1.1 成分胰蛋白胨 20.0g葡萄糖 1.0g磷酸氢二钾 2.0g磷酸二氢钾 2.0g氯化钠 5.0g吐温80 1.5ml蒸馏水 1000mlpH 7.0±0.21.1.2 制法将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右校正pH，分装适当的容器，121℃灭菌15min，取出后冷却至50℃～55℃，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5μg/ml），分装225ml备用注：如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月1.2 新生霉素溶液1.2.1 成分新生霉素 25.0mg蒸馏水 1000ml1.2.2 制法将新生霉素溶解于蒸馏水中，用0.22μm过滤膜除菌，如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月1.3 临用时每225ml志贺氏菌增菌肉汤（1.1）加入5ml新生霉素溶液（1.2），混匀2 麦康凯（MAC）琼脂2.1 成分蛋白胨 20.0g乳糖 10.0g3号胆盐 1.5g氯化钠 5.0g中性红 0.03g结晶紫 0.001g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mlpH 7.2±0.22.2 制法 将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右校正pH，分装，121℃高压灭菌15min。

冷却至45℃～50℃，倾注平板注：如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存二周3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂3.1 成分酵母膏 3.0gL-赖氨酸 5.0g木糖 3.75g乳糖 7.5g蔗糖 7.5g脱氧胆酸钠 1.0g氯化钠 5.0g硫代硫酸钠 6.8g柠檬酸铁铵 0.8g酚红 0.08g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mlpH 7.4±0.23.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，校正pH另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平皿注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处本培养基宜于当天制备，第二天使用使用前必须去除平板表面上的水珠，在37℃～55℃温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干另外如配置好的培养基不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存二周4 三塘铁（TSI）琼脂4.1 成分蛋白胨 20.0g牛肉浸膏 5.0g乳糖 10.0g蔗糖 10.0g葡萄糖 1.0g硫酸亚铁铵(NH4)2Fe(SO4)·6H2O 0.2g氯化钠 5.0g硫代硫酸钠 0.2g酚红 0.025g琼脂 12.0g蒸馏水 1000mlpH 7.4±0.24.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加于400ml蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热使完全溶化，冷却至25℃左右校正pH至7.4±0.2。

另将琼脂加于600ml蒸馏水中，静置约10min，加热使完全溶化将两溶液混合均匀，加入5%酚红水溶液5ml，混匀，分装小号试管，每管约3ml于121℃灭菌15min，制成高层斜面冷却后呈桔红色如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月5 营养琼脂斜面5.1 成分。