DNS比色法测定还原糖及总糖实验报告.doc
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DNS比色法测还原糖标准曲线绘制及测定Tr21培养液中初始和最终还原糖及总糖含量实验报告1. 研究背景木霉菌在发酵过程中，利用碳源导致发酵液中糖含量的变化，其中还原糖是一个主要的反映参数还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）在碱性条件下生成棕红色物质（3-氨基-5-硝基水杨酸），在一定范围内，棕红色物质颜色深浅的程度与还原糖的含量呈一定的比例关系糖含量的不同变化一定程度上体现着Tr21不同的生长阶段，从而为控制及优化发酵过程提供科学依据2. 实验目的3，5-二硝基水杨酸比色法测定Tr21发酵液中还原糖含量，利用糖含量这个参数，控制发酵过程3. 实验原理在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量黄色 桔红色4. 实验材料发酵液（5天）：Tr121（A2）实验材料：3，5-二硝基水杨酸，氢氧化钠，苯酚，亚硫酸钠，酒石酸钾钠，葡萄糖，蒸馏水实验器材：可见分光光度计，电子天平，真空干燥箱，数显恒温水浴锅，离心机，移液器，枪头，500ML容量瓶，试管，500 ml 烧杯，1000ml量筒5. 实验方法5.1试剂配制（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。
2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中5）0.1% 酚酞指示剂 （6）6 mol/L HCl溶液5.2 、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水试剂管号012345678葡萄糖标准液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4水杨酸溶液(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀λ=540nm处测定吸光度00.0770.20.3190.4240.5430.6550.7610.856以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如图一：5.3 .1 培养液中初始总糖与还原糖的测定准确量取5ml培养液，定容至50 ml，作为还原糖测定样品液。
准确量取1ml发酵液并加蒸馏水定容至10ml放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全如已水解完全，则不呈现蓝色水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到50ml，用于总糖测定试剂空白还原糖总糖样品溶液(ml)01.01.0蒸馏水(ml)2.01.01.0水杨酸(ml)1.501.501.50将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀λ=540nm处测定吸光度00.3110.228样品溶液中还原糖和总糖00.5940.445.3.2 发酵液中最终总糖与还原糖的测定发酵液2500rpm离心20min，取5 ml，作为还原糖测定样品液准确量取5ml发酵液悬液放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 5ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全如已水解完全，则不呈现蓝色水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到50ml，用于总糖测定。
试剂空白还原糖总糖样品溶液(ml)01.01.0蒸馏水(ml)2.01.01.0水杨酸(ml)1.501.501.50将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀λ=540nm处测定吸光度00.150.014样品溶液中还原糖和总糖00.2990.05测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量6. 结果处理 按下式计算出样品中还原糖和总糖的浓度： 还原糖浓度（g/ml）= m /V*稀释倍数/1000 总糖浓度（g/ml）= m /V*稀释倍数*0.9/1000式中：m──反应液中还原糖或总糖的质量：mg；V──反应液的体积：ml；1000──mg换算成g的系数得：初始培养液中：还原糖浓度（g/ml）=0.594/1*10/1000 =5.94/1000总糖浓度（g/ml）=0.44/1*50*0.9/1000 =19.8/1000最终培养液中：还原糖浓度（g/ml）=0.299/1*1/1000 =0.299/1000总糖浓度（g/ml）=0.05/1*10*0.9/1000 =0.45/1000图一：。
