猪丹毒杆菌的检验课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验六,猪丹毒杆菌检验,一、实验目的,?,1,、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；,?,2,、了解检验猪丹毒杆菌的意义二、实验说明,猪丹毒,(Swine erysipelas),是由猪丹毒杆菌,(Erysipelothrix,rhusiopathiae),引起的一种人畜共患传染病，其主要特征,为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及,皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体,丹毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，,对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现,la,1b,2-24,和,N,型共,26,个血清型，大约,80%,以上的猪源性分离株属,1,型,(la,和,1b),和,2,型，我国优势血清型也为,1a,1b,和,2,型类丹毒,不规则鲜红色斑块,“,大红袍,”,心瓣膜增生,：疵状心内膜炎的病变，,二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物,大紫肾,：典型的败血脾,;,肾淤,血、肿大,脾充血肿大,三、检验程序,检,样,显微镜检查,直接涂片,革兰氏染色,镜检,血液或血清,琼脂平板,选取可疑菌,落涂片镜检、,纯培养,马丁肉汤,临症表现,病理变化,染色镜检,分离培养,分离培养,动物试验,生化反应,PCR,鉴定,猪丹毒杆菌,血清型鉴定,结果报告,四、操作步骤,（一）增菌,以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样,品转至营养肉汤中，于,36,士,1,培养,8 h10h,。

二）分离和培养,对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼,脂培养基上，,37,培养,24,48h,或经,TSB,肉汤,37,培养,24h,后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，,37,培,养,24h,血清琼脂,：菌落特,征：细小、圆形、,透明、凸起、灰白,色、有光泽、质软、,露珠样、易混悬于,盐水中血液琼脂,：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血,环（,溶血）,TSB,肉汤,：轻度,混浊，振动试管,呈现出云雾状，,类似试管刷，有,少量灰白色粘稠,沉淀，不形成菌,膜和菌环革兰氏染色，显微镜观察,：分离菌均为革兰氏阳性杆菌，菌,体细长、长短不一，有时呈长丝形，单独存在，有时呈短,链或,V,形排列四、操作步骤,（三）生化实验,?,自,TSA,琼脂平板上分别挑取,2,个以上典型或可疑菌落，接,种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺以无菌操作将各菌分别穿刺接种至,SIM,培养基中，将所有,试管置于,37,下培养,24-48,小时如试管,5,：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢,（变黑）四、操作步骤,（三）生化实验,?,将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于,20,培养,7,天，逐日,观察明胶液化现象。

如室温高，培养基自行溶化时，可与,冰箱内放置,30,分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳,性V-P,试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验四、操作步骤,（三）生化实验,项目,葡萄糖,乳糖,结果,项目,枸盐酸盐,靛基质,结果,-,-,果糖,蔗糖,山梨醇,鼠李糖,M.R.(,甲基红,),-,-,-,-,硫化氢,甘露醇,七叶苷,木糖,V-P,-,-,-,-,氧化酶,硝酸盐还原,-,-,过氧化氢酶,明胶,-,不液化,注：表示阳性,;,表示阴性猪丹毒杆菌的检测步骤,1,、引物：,P1,：,5-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3,P2,：,5,-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3,（四）聚合酶链式反应（,Polymerase Chain,Reaction,，,PCR,）,（四）聚合酶链式反应（,Polymerase Chain,Reaction,，,PCR,）,猪丹毒杆菌的检测步骤,2,、反应体系,反应总体积为,25 L,，其中含有,12.5 L,的,PCR Master,Mix,，,10 mol/L,上、下游引物各,1 L,1 g/L DNA,模板,5,L,，灭菌双蒸水,6.5 L,。

四）聚合酶链式反应（,Polymerase Chain,Reaction,，,PCR,）,猪丹毒杆菌的检测步骤,3,、反应条件：,95,，,5min,95,，,1min,63,，,1min 40,次循环,72,，,1min,72,，,10min,（四）聚合酶链式反应（,Polymerase Chain,Reaction,，,PCR,）,猪丹毒杆菌的检测步骤,4,、,DNA,的提取：,将被检菌株接种于,3 mL TSB,肉汤中，,37,振荡培养,(150 r/min)1012h,后，取,1 mL,培养液于,1.5 mL,离心管中，经,12000 r/min 4,离心,5 min,，弃去上,清液，用,200L ddH,2,O,或者,TE,缓冲液,(pH8.0),重悬沉淀，,再于沸水浴中,10 min,，随后立即在冰中冷却，然后在,12000 r/min,及,4,条件下离心,5 min,，取上清液为猪丹毒,杆菌基因组,DNA,模板四）聚合酶链式反应（,Polymerase Chain,Reaction,，,PCR,）,猪丹毒杆菌的检测步骤,5,、电泳检测：取,5L PCR,产物直接经,1%,琼脂凝胶（含,0.5g/mL,溴化乙锭,）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。

四）聚合酶链式反应（,Polymerase Chain,Reaction,，,PCR,）,M,1,2,3,4,2000,1000,750,500,250,100,937,bp,猪丹毒杆菌,PCR,检测结果电泳图,说明：,M,DL2000,；,1,阳性对照；,2,、,3,被检样品；,4,阴性对照,四、操作步骤,四、动物实验,1.,实验材料,实验动物：雌性昆明小鼠，体重,1822g,器材：,1ml,注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）四、操作步骤,四、动物实验,2.,实验步骤,每组取,2,只小鼠，以每只,0.2mL,剂量进行一次性腹腔注射,1,只，另一只注射,0.2mL,无菌生理盐水，观察，分别记录,小鼠死亡状况四、操作步骤,四、动物实验,3.,病理解剖和细菌分离,病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，,触于血清平板，,37,培养,1218h,记录结果六）结果与报告,综合以上生化试验、,PCR,鉴定和动物实验的结果，报告样品中,检出或未检出猪丹毒杆菌。