绵羊卵巢组织研究论文初稿.doc

2023届毕业生毕业论文绵羊卵巢组织研究学 名 努日艾合麦提·塔西学 号 2023109124所属学院 动物科学学院 专 业 动物医学 班 级 动医民14-1 指导教师 郑毛亮 塔里木大学教务处绵羊卵巢组织 研 究（努日艾合免提·塔西） (塔里木大学843300) 【摘要]为观察绵羊正常卵巢组织的形态结构，采用苏术精一伊红(hcmatoxylirrcosin, HE)染色法制作绵羊卵巢组织石蜡切片结果显示，在切片制作过程中存在的问题主要包括染色不均、染色对比不明显、过度染色、染色过浅和切片出现斑点等在试验过程中可通过充分分化、蓝化、充分水洗等因素的控制来提高切片的染色效果，该方法可为动物卵巢及卵泡染色切片制作提供技术指导关键词:绵羊；HF染色；卵巢；切片；优化；HF染色法是石蜡切片技术中常用的染色法苏术精碱性染液可使细胞核内染色质与胞质内核糖体着蓝紫色;伊红酸性染料可使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，作为组织学、月王胎学、病理学教学与科研中最基木的技术方法而被广泛使用[1]。

木试验通过HF染色技术制作石蜡切片，该方法是一种多步骤、多因素决定的过程，在试验中由于操作不当，经验不足，以及实践的使用和时间的掌握等诸多因素影响，出现切片脱落、染色不均匀、糊不清、褶皱，及细胞核和细胞质对比不明显等现象，从而影响使用效果HF染色切片制作过程中出现的问题进行了探究，并提出解决方案，这对相关的试验操作具有指导意义1材料与方法1. 1试验材料 木试验选用成年健康母羊，屠宰后取卵巢1.2主要试剂和仪器Bouin氏固定液、包埋纸盒、染色缸、融蜡箱、切片机、恒温箱、载玻片、小烧杯、吸水纸、移液枪、盖玻片、石蜡，1%盐酸水溶液、0.5%伊红(水溶性)溶液、各梯度的乙醇、二甲苯、苏术精染液、伊红染液、中性树胶、蒸馏水1. 3试验方法1. 3. 1绵羊卵巢的处理:将卵巢投入预先配好的固定液中(10%福尔马林Bouin氏固定液等)，使组织蛋白质变性并防止几细胞死亡后自溶或细菌分解1.3.2脱水透明:用低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织中的水分，再将组织块置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精，才能浸蜡包埋1. 3. 3浸蜡包埋:将透明处理的组织块置于熔化的石蜡中，放入熔蜡箱保温。

待石蜡完全浸入组织块后进行包埋1. 3.4通切片与贴片:将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为5~8um薄片切卜的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放朽45℃恒温箱中烘干[2]1. 3.5脱蜡染色:染色前，用二甲苯（Ⅰ）脱蜡5min，入二甲苯(Ⅱ)中脱蜡 10min，用吸水纸吸干液体;入100%乙醇（Ⅰ）5min，入100%乙醇（Ⅰ） 5min，用吸水纸吸干液体;入95%乙醇3 min并过流水2 min，用吸水纸吸干水分苏术精染色4~8 min，并用1%盐酸水溶液分化5~10s，自来水洗返蓝15~30 min;0. 5%伊红(水溶性)染色30 s,95%乙醇（Ⅰ）脱水5 min，用吸水纸吸干液体;95%乙醇(Ⅱ)脱水5 min，用吸水纸吸干液体;入100%乙醇（Ⅰ）5min,100%乙醇(Ⅱ) 2 min,用吸水纸吸干液体；入二甲苯（Ⅰ）中透明2~3min，二甲苯(Ⅱ)中透明5 min用移液枪吸取适量中性树胶于载玻片上，盖上盖玻片待凝固后观察结果2结果与分析2. 1正常染色 经显微镜观察，正常HF染色切片见图1-A,l-B图1-A可见卵巢上有腔卵泡的存在，图1-B可见卵巢卵泡颗粒细胞(GC）、内膜细胞（TC)的细胞核呈蓝紫色;而周围的细胞质、纤维被染成粉红色，切片染色均匀无褶皱，细胞核和细胞质对比明显。

2.2染色异常 在切片制作尤其是染色过程中常会出现染色异常情况，从而影响了正常的组织形态观察图1-C显示细胞核染色苍白、暗淡，细胞核与细胞质染色对比度差出现这类问题有三种原因:切片在苏术精染液停留时间太短;苏术精染液过度氧化，失去染色能力;分化步骤处理时间过长可进行切片重新染色如果组织在酸性固定液Zenker,Bouin及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加其在苏术精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善细胞核的着色 图1 - D显示细胞核过染，核膜、核仁等不清晰，细胞质含有大量的苏术精，导致细胞核与细胞质比例失调这主要是由于在染色过程中切片在苏术精染液停留过长、切片太厚、分化步骤时间太短，造成苏术精染液大量分布而占据细胞质位置通过显微镜上卜微调观察，如果只有1 ~ 2层细胞核层次，说明不是因为切片太厚，可经脱色、漂白、重新染色，对染色和分化时间做些适当的调整若是由于切片太厚导致的细胞核过染，则需要重新切片 图1-E显示细胞核呈红、棕色改变这主要由于苏术精染色液过度氧化和切片在苏术精染液染色后返蓝不足提示染色之前检查苏术精染色液的染色能力，发现氧化过度应及时更换;同时，可用流水、温水或弱碱性溶液如稀氨水、0.2%碳酸氢钠溶液等在苏术精染色后，给切片足够的蓝化时间。

图1-F显示伊红着色淡，切片中央区域伊红染色不均匀，可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染;也可能是蓝化液残留过多、切片太薄，或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长因此，在染色前应检查伊红染液的pH值，必要时可用乙酸将pH调节在4.6-5.0之间在脱水时切片在低浓度乙醇停留时间不可过长，低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉[7] 图1-G显示细胞质过染，分色不足，这是由于伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次，缺乏对比提示在染色前适当稀释伊红染液，减少伊红染色时间;切片在乙醇脱水步骤时，停留时间要相对均匀 图1-H显示切片中出现蓝黑色沉淀物，这主要是试验中使用的苏术精染液没有过滤处理，导致苏术精染液中的金属膜熟附在玻片上建议使用半氧化苏术精染色液，如Gill苏术精染液，可以避免金属膜的产生 图1-I可见切片内有大量水珠或云雾状改变，这是梯度乙醇处理后没有完全脱水造成的，因此，所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间后应及时更换 图1-J显示由于组织切片脱蜡不彻底或分化液浓度过大、分化后没有迅速入水终止分化，导致切片染色不均，出现“阴阳脸”，出现这种情况需要重新取材制作切片[8]图1-K显示镜检时切片中出现大片白色斑点，这是由于脱蜡不彻底，染色液因石蜡斑点的残留不能渗透组织着色。

因此，脱蜡时切片在二甲苯中停留时间相对延长或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色[9]3讨论在研究雌性动物繁殖性能中，卵巢组织切片是较常用的用于了解动物卵巢结构与其年龄特征、生理功能、细胞凋亡、蛋白表达相关的常规技术常青等(2001)为观察早期老年大鼠使用外源雌激素后卵巢结构及功能的变化，通过建立早期老年大鼠模型，采用放射免疫法测定使用外源雌激素后外周血液中促卵泡素(FSH)、促黄体素((LH),雌二醇(E2)及辜酮(T)水平，并通过卵巢组织切片观察卵巢结构的改变发现，早期老年大鼠应用雌激素后外周血FSH明显降低，E2水平明显上升，T水平明显降低;同时卵巢门细胞减少，卵巢基质相对增生[10].土朝清等(2006)为探索家兔卵巢典型结构与其年龄的关系，选取不同年龄段的家兔卵巢，常规石蜡切片，HE, Vna~icson和PAS染色，镜检并计数各级卵泡结果表明，2月龄的家兔卵泡开始发育，随年龄的增长发育程度逐渐增强4~ 5月龄卵巢的皮质、髓质分界清楚，未见黄体、闭锁卵泡及间质腺，发育中卵泡由周围向中央排列，与人的卵巢结构较为相似7~8月龄卵巢结构呈性成熟状态，卵巢髓质随着家兔月龄增长间质腺逐渐增多[11]。

陈华絮等(2007)针对常规石蜡切片制作步骤琐、耗时长，试验中所用二甲苯对人体有较大危害的缺点，探讨提高兔卵巢组织石蜡切片质量的制作方法，研究从脱水和透明环节进行技术优化，用正J醇与无水乙醇混合溶液取代常规的脱水剂和透明剂该混合液具有较好的脱水和透明作用镜检结果表明，卵巢组织结构清晰可辨、对比度好、层次分明，组织切片镜检效果良好，具有工序简单、质优、省时和实用性较好等优点[12]杨轩(2023)对家兔卵巢石蜡切片HF染色过程中影响因素进行了研究，在试验过程中通过改变条件进行比较试验，重点分析了染色过程中温度、时间、切片厚度等因素对镜检效果的影响[13] 木研究通过对绵羊卵巢组织切片的制作，并通过镜检效果重点对影响HF染色的因素如切片厚度、染液pH值、染色时间、分化、蓝化等进行分析探讨，对试验中影响镜检效果的相关因素进行了解决并加以优化，这对相关动物卵巢常规切片的制作具有一定的指导意义参考文献[1]刘世新.实用生物组织学技术[M].北京科学出版社,2004,03.[2]汪谦.现代医学实验力法[M]北京人民卫生出版社_,1998,06.[3]刘桂芝.石蜡切片标本的制作过程[J].通化师范学院学报，2004,25（11):90~103.[4]王满贯.HE染色切片的技术操作规范[J].大同医学专科学校学报，2004，(2):21~25.[5J朱有华.浅谈石蜡切片HE染色[J].诊断病理学杂志，1997,4（2）:111~LL2.[6]王风琴，孔佑华.浅谈HE染色切片着色浅的原因以及改进力法[J].济宁医学院学报，2006,29(1):11.[7]李成，贾维民，张希国.石蜡切HE染色着色小良的原因及矫正力法[J].内蒙古医学院学报，2006,28(12):223~224.[8]田玉旺，李琳，朱红艳.常规HE染色易出现的问题、原因及解决力法[J].诊断病理学杂志，2023,15(6):500-~502.[9]曹书芬，国宏莉，张丽，等.石蜡切片HE染色力法的改进[J].郧阳医学院学报，2007,26(5)308.[10]常青，徐惠成，史常.雌激素对老午早期大鼠卵巢结构及功能的影响[J].第三军医大学学报，2023,23(11):1285~1286.[11]王朝清，李瑞华，喇慧，等.家兔卵巢结构的午龄特征[J].新乡医学院学报，2006,23(1):4~47.[12]冻华絮，杨素娇.兔卵巢组织石蜡切片技术的改良[J].生物学杂志，2007,240):i9一60.[13]杨轩.家兔卵巢石蜡切片HE染色影响因素的研究[J].安徽农学通报，2023，15(1):40一41.。