木质素降解微生物的筛选与初步鉴定.doc

目 录摘 要 3Abstract 41 引 言 51.1木质素概述 51.2 木质素降解菌 81.3 木质素的微生物降解机制 91.3.1 侧链氧化 91.3.2 去甲基化和去甲氧基化 101.3.3 芳香环的断裂 101.4 研究目的 112 材料和方法 112. 1 实验材料 112.1.1 木质素 112.1.2 土样 112.1.3 培养基 112.1.4 主要仪器 112.1.5化学试剂 122.2 实验方法 122.2.1 木质素的提取和分离 122.2.2 菌种的分离和筛选 132.2.2.1 菌种的分离：稀释平板法和划线分离法[11][12] 132.2.2.2 菌种的初筛 132.2.2.3 菌种的复筛 132.2.3 菌种的初步鉴定 132.2.3.1 培养特征 132.2.3.2 显微观察 142.2.3.3 生长曲线 143 结果与讨论 143.1 木质素的提取和分离 143.2 木质素降解菌的分离与筛选 143.2.1 菌种的初筛 143.2.2 菌种的复筛 143.2.2.1 目测筛选 143.2.2.2 降解率的测定 143.2.2.3 木质素降解酶活力的测定 153. 3 菌种的初步鉴定 153.3.1 培养特征 153.3.2 显微观察 163.3.3 生长曲线 17结 论 18谢 辞 19参考文献 20木质素降解微生物的筛选与初步鉴定摘 要：从采集的土样中通过稀释平板和划线分离，在以木质素为唯一碳源的培养基中分离获得8个菌株。

在CPDA培养基意义？中加入0.02%愈创木酚制成平板，将以上8个菌株接种培养筛选出3个优势菌种，测定这三个菌种的木质素降解率和酶活力的到最优势菌种，最后对最终菌种进行了初步鉴定关键词：木质素降解；筛选；鉴定 Abstract: By pour plate and streak plate method, 8 strains were obtained from the sample soil while the isolated lignin was used as the sole carbon in the culture medium. In re-screening, with PDA medium containing 0.02% guaiacol, 3 strains were achieved by means of transparent ring, lignin degradation rate and enzyme activity. Finally, the optimum one was preliminarily identified as a mold.Keywords: lignin-degradation; screening; identification 1 引 言1.1木质素概述木质素(Lignin)是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中， 主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。

简介木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物(纤维素是第一位)　　木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇） 形成的一种复杂酚类聚合物木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力　　因单体不同，可将木质素分为3种类型[1]：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素类型（syringyl lignin，S-木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素（guajacyl lignin，G-木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyl lignin，H-木质素）；裸子植物主要为愈创木基木质素（G），双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素（G-S），单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（G-S-H）从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定显色反应（加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色）的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。

木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭　　木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则很少见含有一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外另外，虽然其详细情况目前尚不得而知，但木质素的构造与多酚非常相似，故此，木质素与多酚应该有密切的关系总之，二者对于身体都有很好的作用 木质素是自然界中含量极丰富，结构极复杂的一种天然高分子化合物它广泛存在于高等植物细胞壁中，是含量仅次于纤维素的生物多聚体木质素是木材水解工业和造纸工业的副产品，也是作物秸秆以及城市生活垃圾中一种较常见的难降解物质，可造成严重的环境污染微生物降解是处理木质素的一种安全、无公害的方法，也是目前国内外的研究热点在这一领域的研究主要包括2个方面：① 研究降解木质素的微生物及其降解能力能降解木质素的微生物种类较多，白腐菌因其特殊的代谢类型及独特的细胞外降解机制，能降解各种难生物降解的有机污染物而被广泛研究[2]但对白腐菌等微生物降解木质素的研究目前主要停留在感性阶段，白腐菌如何使木质素高聚物发生解聚反应生成木质素单体，如何进一步使单体发生氧化及芳香环的破解，所知甚少；各种微生物对哪种类型的木质素降解效果较好而对其他木质素降解不明显这类问题，现阶段研究也相对较少；② 对环境因素的调控，主要包括调节堆肥[3]及水处理过程中的温度、氧浓度、pH、碳氮含量及碳氮比等，使环境因素尽最大可能地达到微生物降解的最适环境。

由于木质素是由3种不同的单体组成，并且单体之间的连接键也有显著区别，因此，从木质素的层次出发，忽视其本身组成的区别对环境进行的调控不具说服力(即使是同一微生物，在相同环境下处理不同的木质素，其降解程度可能完完全不同)而如果通过研究不同木质素在各种微生物作用下的生化降解机理，可以有针对性地寻求各类木质素的最佳降解菌种，并分别对其环境影响因素进行深入研究，从而达到提高降解效果的最终目的另外，现阶段对降解所产生的各种物质具体结构不清楚，而这些物质的pH、溶解度、金属螯合能力、氧化还原能力、微生物毒性等对环境都有着深远影响[4] 木质素是由苯丙烷结构单元组成的高分子化合物，它是制浆造纸废水COD与色度形成的主要原因，因此也便成为使国家基础性与支柱性产业之一的制浆造纸工业成为污染大户的罪魁祸首，与废水中常见的其他成分如纤维素、半纤维素等降解物不同木质素结构中含有各种生物学稳定的复杂键型，而含有不易水解且重复的单元，并且木质素对酶的水解作用成抗性，降解周期长，是目前公认的微生物难降解的芳香族化合物之一传统的物理和化学方法由于存在能耗高、污染大等缺点，使得人们越来越热衷于木质素生物降解的研究。

自然界中木腐微生物如真菌中的白腐菌、褐腐菌、软腐菌和细菌中的放线菌以及其他一些杆菌和梭菌等，可分泌胞外酶，在一些小分子物质的辅助下降解木质素，是自然界中降解木质素的重要环节木腐微生物的存在，使人类通过廉价手段降解和利用木质纤维素成为可能，筛选培育高效降解木质纤维素的菌种和建立高效木质纤维素生物降解体系，可以促进人类通过廉价手段降解和利用木质纤维素物质，为今后实现其进入工业化生产奠定良好的基础　　随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入 ,天然高分子所具有的可再生、可降解性等性质日益受到重视废弃物的资源化与可再生资源的利用 ,是当代经济与社会发展的重大课题 ,也是对当代科学技术提出的新要求在自然界中 ,木质素的储量仅次于纤维素 ,而且每年都以500 亿吨的速度再生制浆造纸工业每年要从植物中分离出大约 1.4亿吨纤维素，同时得到 5000万吨左右的木质素副产品，但迄今为止，超过95%的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉，很少得到有效利用　　化石能源的日益枯竭、木质素的丰富储量、木质素科学的飞速发展决定木质素的经济效益的可持续发展性木质素成本较低，木质素及其衍生物具有多种功能性，可作为分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂作用，木质素对人类可持续发展最为重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，其应用前景十分广阔。

　　研究木质素性能和结构的关系，利用木质素制造可降解、可再生的聚合物木质素的物化性能和加工性能、工艺成为目前木质素研究的障碍 　　Kim JW 等研究了煤与造纸黑液的共液化，他们认为木质素的热解形成苯氧自由基，以及其它反应性自由基在低温下对于煤基有很重要的热解作用这些自由基是高效的活性中间体，能够使得煤中的亚甲基断裂从而促进煤的解聚　　Akash BA 等研究了煤与木质素共液化动力学采用伊利诺斯州烟煤与腐蚀性的木质素混合物，反应在初始氢压 1.1 MPa、375°C、四氢萘作溶剂下完成的煤和木质素混合物液化产品与单独用煤液化得到的产物相比，含较少苯不溶物排阻色谱研究表明，煤和木质素混合物液化产品平均分子量比用单煤或单木质素液化得到的产品的分子量要低试验数据表明，在加入木质素后煤的转化率提高了22%，通过研究分析得到了描述化学反应的数学模型他们对液体产品循环的影响也进行了研究初步试验表明，随着产品循环的增加，煤总的分解率是减小的以上的研究表明，当煤与木质素共液化时，煤的液化温度可降低而且不同研究者得到的实验结果都表明，与煤单独液化相比，煤与生物质共液化所得到的液化产品质量得到改善，液相产物中低分子量的戊烷可溶物有了增加。

产生这些结果的原因可能是木质素的热解形成苯氧自由基，以及其它反应性自由基在低温下对于煤基有很重要的热解作用当使用含有苯酚类基团的溶剂进行液化时，煤的转化率也有显著增加，虽然国内外对生物质与煤的共液化取得了一定的进展，但还有许多不够深入，以后应着力研究煤与木质素共液化工艺条件，改性生物质与煤液化试验研究、木质素与煤共液化动力学、木质素与煤催化剂的专用高效催化剂方面的研究1.2 木质素降解菌 目前，影响人们对植物纤维素原料高效利用的关键问题之一是木质素的阻碍作用要想有效利用木质纤维素原料中的纤维素和半纤维素就必须首先将它们从木质素的束缚中解脱出来，传统的物理和化学方法由于存在能耗高、污染大等缺点，使得人们越来越热衷于木质素生物降解的研究[5]从20世纪70年代开始，国外科学家对一些降解木质素能力强并具有较强选择性的菌种进行了较为深人的研究．有的菌种或其产生的高效木质素降解酶已经被应用到某些工农业生产中[6]我同在此方面的研究起步较晚，具有较强降解木质素能力并有较好工农业应用前景的菌种也较匮乏在自然界中能够降解木质素并产生相应酶类的生物只占少数，主要有真菌、细菌及微生物群落真菌中属于担子菌纲的白腐菌是最典型、最有效的木质素分解茵。

白腐菌通过其分泌的木质素降解酶降解木质素由于不同白腐菌分泌酶的种类和活性不同，它们降解木材、木质素的能力也就不同白腐菌亦能分泌纤维素酶和半纤维素酶，因此在降解木质素的同时还能降解纤维素和半纤维素，这对植物纤维资源的综合利用及在某些工业中的应用，如生物制浆、生物漂白等带。