产品手册│腺相关病毒AAV表达系统产品说明书.doc

产品手册│腺相关病毒（AAV）表达系统产品说明书本产品仅限用于研究，严禁用于疾病诊断本产品仅供购买方内部研究使用，未经Vigenebio公司书面许可，严禁转售产品有限责任担保Vigenebio保证您收到的产品符合产品目录上的规格本担保规定了Vigenebio更换产品的责任Vigenebio不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证Vigenebio不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责目录腺相关病毒安全操作规范………………………………………………………………… 4个人保护措施……………………………………………………………………………… 4不慎接触病毒时的急救…………………………………………………………………… 5消毒处理…………………………………………………………………………………… 5腺相关病毒的保存………………………………………………………………………… 5AAV载体概述……………………………………………………………………………… 5重组AAV作为基因传递和表达载体的优势………………………………………………… 6Vigenebio腺相关病毒的优势………………………………………………………………7VigenebiorAAV产品简介……………………………………………………………………7腺相关病毒颗粒生产流程………………………………………………………………… 9-腺相关病毒重组克隆构建……………………………………………………………… 12-细胞冻存流程………………………………………………………………………………12-细胞复苏流程………………………………………………………………………………12-细胞培养流程………………………………………………………………………………12-AAV 病毒包装………………………………………………………………………………13-AAV病毒纯化………………………………………………………………………………14-病毒浓缩……………………………………………………………………………………14-病毒滴度检验………………………………………………………………………………14腺相关病毒感染目的细胞预实验…………………………………………………………15AAV实验举例……………………………………………………………………………… 16常见问题解答…………………………………………………………………………………23参考文献………………………………………………………………………………………26腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2生物安全二级生物安全柜中操作病毒。

2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴口罩和手套3. 请小心操作，避免产生气雾或飞溅被病毒污染的超净工作台，请立即用70%乙醇加1% SDS溶液擦拭干净接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请使用新鲜配制的10％漂白粉进行消毒操作后丢弃4. 用显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照观察完毕，请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台5. 离心病毒时，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后进行离心，请尽量使用组织培养室内的离心机6. 实验完毕脱掉手套后，请立即用肥皂和水清洗双手个人保护措施1. 使用一次性手套2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使用一次性手术服或是相当的衣物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服3. 佩戴护目镜或是面罩4. 所有的操作应当是在 Class II 生物安全柜中进行如果实验条件不能满足，则应当在空气稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是气溶胶与人体接触–眼，皮肤或是粘膜用大量清水冲洗眼睛或是其他接触的部位至少15 分钟2. 含病毒的针头或是其他利器刺破皮肤。

伤口立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟，然后用大量清水冲洗消毒处理对AAV 最有效的消毒剂是新鲜配制的1%次氯酸钠溶液♦ 配制时，将84 消毒液原液加水稀释♦ 浸泡15min 以达到消毒目的♦ 可以用它处理可回收的物品如玻璃器皿或是污染废液（终浓度是1%），但如果是不锈钢器物切不可直接擦拭，否则会引起表面腐蚀其他的处理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS 溶液，还可以121℃高温消毒1小时腺相关病毒的保存收到产品后，请根据实验所需的量在无菌操作台中将病毒进行分装，并于-80 ℃冰箱冻存分装病毒时请将病毒始终放置在冰上注：请避免反复冻融AAV载体概述 腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链DNA病毒，是细小病毒家族的一员，通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能进行自我复制在没有辅助病毒的情况下，AAV可在哺乳动物细胞中长期潜伏现阶段已发现的 AAV 有 12 种的血清型（AAV1 至 AAV12）和 130多种突变型[1] 不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别[2]，这也导致不同血清型转染的细胞类型和感染效率也各不相同。

在基因治疗中，将携带有外源基因的重组腺相关病毒定点整合到宿主基因组，既能克服随机插入所导致的染色体缺失和基因重排等潜在危险，又可以达到长期治疗的目的 野生型AAV基因组编码两大开放阅读框架(open reading frames，ORF) rep和cap，它们位于两侧的末端倒转重复序列(interted teminal repeats，ITRs)之间在 Vigenebio的AAV 病毒基因传递系统中，只有ITRs是复制和包装所必需的顺式元件，rep和cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒AAV rep/cap Vector中，转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度在辅助质粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector的帮助下，仅需两端的 ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒 重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具[3]，其具有广泛的宿主范围及组织感染能力，既能感染分裂细胞，也能转导外源基因进入非分裂细胞，长期表达外源基因，而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力在Vigenebio公司的AAV病毒基因传递系统中，包含末端重复序列(ITRs)的载体质粒pAV-FH AAV 载体与包含rep/cap 基因的辅助质粒pAAV-rep/cap载体没有任何共同区域，避免通过重组而恢复出野生型病毒，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。

我们的AAV病毒基因传递系统可以生产出重组病毒滴度≥1011 病毒颗粒/毫升的病毒，浓缩后滴度最高可达1014 病毒颗粒/毫升，可以最大程度保证在动物细胞中的基因传递rAAV进入细胞后，作为附加的DNA能稳定存在基因的表达通常在第2〜7天出现峰值，并可在体内持续数周甚至数月腺相关病毒基因传递和表达的优势1.宿主范围广：随时可转染的AAV可高效感染分裂和非分裂细胞；2.多种血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和AAV9等；3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分别由独立的质粒表达；未发现AAV对人体致病，rAAV去除了wtAAV基因组的96%，进一步保证了安全性；4.免疫原性低：AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；Vigenebio腺相关病毒的优势1）载体全：不同的启动子（神经特异性启动子Human Synapsin、CamkIIα、GFAP等）和多种报告基因（EGFP、mCherry、RFP和luciferase等）可供客户选择； 2)  货期短：AAV克隆载体均与我们18,000个预制人类全长cDNA ORF克隆载体MCS区通用，行业中最短的生产周期； 3）滴度高：可提供 1012V.G/ml及以上滴度的病毒.，最高可达1014V.G/ml； 4）服务优：可根据客户的具体需求提供特殊定制服务。

Vigenebio rAAV产品简介Vigenebio独有的专利技术和创新性的rAAV载体和最完善的AAV 表达系统，可用于体内和体外表达shRNA，human ORF和CRISPR，具有稳定可靠、重复性好、纯度高、滴度高的优点AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组人腺相关病毒这种系统利用已经明确与调节AAV 复制和表达的腺病毒基因产物，并且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（Cis质粒、辅助质粒、Rep/Cap质粒）组成生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4 和VA RNA 基因）大部分由与其他质粒共转染进细胞的pHelper 质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主细胞提供Rep 和Cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒载体中，实际上在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，Rep 和Cap 基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。

Cis质粒、辅助质粒与Rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力Vigenebio的腺相关病毒载体ITR序列Rep/Cap基因分别由独立的质粒表达,具有高度安全性图1为rAAV进入细胞和转运的过程1.rAAV载体Vigenebio为您提供了多种腺相关病毒载体包装 AAV 无需辅助腺病毒，非致病性、免疫原性低AAV 包装系统包括辅助质粒和Rep/Cap 质粒，ITR 序列和rep/cap 基因分别位于独立的质粒，安全性高多种血清型 (AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)可供选择根据不同客户的需要，提供了分别适用于human ORF、shRNA和CRISPR 、TALEN 基因组靶向操作服务的AAV载体了解更多AAV载体的详细信息，欢迎访问我们的官方网站2.rAAV克隆服务2.1 rAAV Human ORF 克隆服务  Vigenebio为human ORF克隆设计的pAV-FH AAV载体，具有Amp抗性、CMV启动子，带有Flag-His标签多克隆位点与Vigenebio的human ORF穿梭克隆相兼容。

非常适于哺乳动物ORF的表达2.2 rAAV shRNA克隆服务Vigenebio为您提供了多种表达shRNA的rAAV，包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP同时，也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务2.3 rAAV载体容量腺相关病毒载体能够感染分裂和非分裂细胞毒性和免疫原性低，适合以相对较高的转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因但AAV载体的外源基因容纳量有限，两个ITR之间的空间只有4.7kb，因此可插入的外源基因为3.5kb甚至更小请参阅本表选择适合您的病毒载体系统腺病毒腺。