Matrigel体外侵袭实验划痕实验MTT试验的详细步骤及试剂.docx

五、Matrigel体外侵袭实验所需：1、Transwell 小室2、 上层培养液：含1 Og/L BSA的无血清培养液3、 细胞：实验细胞4、 基质胶：Matrige 1基质胶为了方便运输和保存，一般是在-20°C(至少保存3 个月)，呈固体状态使用前要将Matrige 1提前放入4C冰箱冰上过夜(12h), Matrige 1即融化为液体状态备用，避免反复冻融在冰冻和解冻过程中可能会发 生颜色变化属正常现象，一旦解冻，晃动瓶子使其分散均匀Matrige 1冰上维持 液态，22〜35C可迅速凝结成胶，使用前接触Matrige 1的试管、移液吸头等均须 4C预冷5、 下层培养液：含FBS或趋化因子的培养液6、 细胞培养板： 12孔板， 24孔板等十二、Matrigel体外侵袭实验1. 实验前的准备(1)使用前要将Matrige1提前放入4C冰箱过夜，溶胶⑵接触Matrige1的试管、移液吸头等均须4C预冷2．包被基底膜(冰上进行)(1) 冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrige1基质成匀浆状2) 根据使用需要，用无血清的冷细胞培养基稀释Matrige1胶(稀释比例根据不 同细胞系，比例约为 1： 6〜1： 3)。

3) 将稀释胶包被于所需的Transwe11上室中，包被量至少覆盖整个生长表面，例120卩1稀释胶加到12孔transwell上室中4) 37 C孵育1小时5) 去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻冲洗3. 水化基底膜吸出培养板中残余液体，每孔加入50卩1含10g/L BSA的无血清培养液，37C， 3Omin4. 制备细胞悬液(1) 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12〜24h，进一步去除血清的影响2) 常规消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，PBS洗1〜2遍，用含10g/L BSA的无血清培养基重悬调整细胞密度至1〜10x105 个/m1 (一般不超过5x105个 /m1)5. 接种细胞(1)取细胞悬液加入 transwell 小室不同公司不、同大小的 transwell 小室对细胞 悬液量有不同要求，请参考说明书24孔板小室一般200卩1, 12孔板加400卩12)下室加入含FBS或趋化因子的培养基，24孔板一般加入500卩1, 12孔板加入 800卩1特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，下层培养液的趋 化 作用就减弱甚至消失，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室 放进培养板 。

6. 培养细胞常规培养12〜48小室(主要依据肿瘤细胞侵袭能力而定)7. 染色和计数(1) 湿润的棉签擦去上室上面的费侵袭细胞(2) 用 95%的无水乙醇或甲醛固定 10 分钟，在用蒸馏水洗 3 次⑶移去transwell，倒置风干4) 用 0.005%结晶紫染色 40 分钟，蒸馏水洗 3 次5) 切膜，用液体石蜡固定，封片，显微镜观察十三、划痕实验1、 在 6 孔板底面利用直尺用记号笔每隔 0.5〜1cm 均匀的划横线，每孔至少穿 过 5 条线2、 在6孔板中加入5〜8x105个细胞/孔，掌握为过夜能铺满3、 第二天用无菌10卩1枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂 直，不能倾斜4、 分别在孵育 0h、 4h、 8h、 12h、 24h 时光学显微镜下测量伤痕距离并记录， 倒置显微镜下采集图像，观察各组细胞迁移情况5、 绘制折线图，横坐标为时间，纵坐标为距离十四、 MTT 实验1、 接种细胞：用含 10%FBS 的培养液配成细胞悬液，以每孔 1000〜10000 个细胞接种96孔板，每孔体积200^1.2、 培养细胞：同一般培养条件，培养 3〜5 天(可根据实验目的和要求决定 培养时间)。

3、 呈色：培养3〜5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20卩1继 续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需 要离心后再吸弃孔内培养上清液每孔加150MDMSO，振荡10分钟， 使结晶物充分溶解4、 比色：选择 572nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录 结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线\ Y * ■、'八■，I [ 1* —r-. r *注意事项：1、 选择适当的细胞接种浓度2、 避免血清干扰：一般选小于 10%的胎牛血清的培养液进行实验在呈色 后尽量吸尽孔内残余培养液3、 设空白对照:与实验平行不加细胞只加培养液的空白对照其他实验步骤 保持一致，最后比色以空白调零MTT实验吸光度最后要在0〜0.7之间，超出这个范围就不是直线关系IC50 是半抑制率，是抑制 50%的时候的药物浓度把药品稀释成不同的浓度， 然后计算各自的抑制率，以药品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，然后得到 50%%抑制率时候的药品浓度，就是 IC50。