胡俊论文 不同水中细菌总数及大肠菌群的测定.doc

2011届本科生毕业论文 水中细菌总数及大肠菌群的测定不同水中细菌总数及大肠菌群的测定胡俊（化学与生命科学院2007级生物科学班）指导老师：王海潮摘要：本实验采用平板菌落计数法、多管发酵法和滤膜法等方法测定东区自来水、珍珠湖和柳溪水中细菌总数和总大肠杆菌群，按照我国饮用水卫生标准（GB5749-85）规定每毫升水样细菌总数37℃培养24h不得大于100个，每升水中总大肠菌群37℃培养48h小于3个，来判断这三种水是否符合饮用水标准结果表明：自来水的细菌总数为30CFU/mL，总大肠菌群数1CFU/L；珍珠湖水的细菌总数为1.0×104CFU/mL，总大肠菌群为2.4×103CFU/L；柳溪湖水的细菌总数为3.0×105CFU/mL，总大肠菌群为2.8×103CFU/L自来水符合饮用标准，而珍珠湖和柳溪湖水不适合饮用关键词：细菌总数； 总大肠菌群； 平板菌落计数法； 多管发酵法； 滤膜法引言水对我们的生命起着重要的作用，它是生命的源泉，是人类赖以生存和发展的不可缺少的最重要的物质资源之一人的生命一刻也离不开水，水是人生命需要最主要的物质水也是细菌存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。

水中细菌种类及数量因水源不同而异一般地面水比地下水含菌数量多，并易被病原菌污染许多可致病的细菌种类也常常存在于水中，人们饮用后引发疾病，例如：痢疾、伤寒、霍乱等流行于世界各地，猖狂为虐，大多是饮用水污染了这些病原菌之故[1]水质细菌学检验是培水和污水水质分析工作中的一项重要指标作为水质日常检测的七项指标(色度、浊度、细菌总数、大肠菌群、余氯、铁、锰)之一的细菌总数和大肠杆菌指数，能非常直观地反映水被细菌污染的程度作为水质卫生学检测的两个常用的微生物基础指标，细菌总数和大肠杆菌指数在环境水质监测中起着非常重要的指标意义[2]大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等水的大肠菌群数是指100mL水样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示[3]良好的饮用水细菌总数应小于100CFU/mL,而大于500CFU/mL则不宜饮用，我国饮用水卫生标准规定每毫升水样细菌总数37℃培养24h不得大于100个；每升水中总大肠菌群37℃培养48h小于3个；每升饮用水的水源中，总大肠菌群不得超过1000个[4]。

长期以来，微生物学工作者在探索新的细菌学检测方法方面做了大量的研究工作，一些先进方法应运而生，如快速荧光法和检测片法快速荧光法[5]的原理是通过试剂促进活菌释放出较多的ATP活性物质，当活性物质与荧光酶反应时会发出荧光对荧光计数就能得到细菌总数，该方法只需要短暂培养检测片[6]是一种已经固化好培养基的纸制培养片以3M公司的PetrifilmtmTM (Aerobic CountPlate)检测片为例，在检测时先用移液管在培养纸面上滴加lmL水样，马上盖上保护膜再用有凹面的压板压出圆型(压出的凹人体积正好为lmL)，lmin后水样即溶解，培养基并固定，最后倒置培养本次实验采用传统的平皿计数法检测水质中的细菌总数，不需要复杂的仪器和试剂，操作简单，方便   水中大肠菌群的传统检验方法包括：试管发酵技术和滤膜过滤技术现在新兴发展的方法包括：酶活性检测法、纸片法、免疫学方法、分子生物学方法和试剂盒法等由于样品中大肠菌群的数量通常很少，因此发展特异、敏感的检测方法至关重要，新的检测体系可能会满足这一要求，但技术上的复杂性以及检测成本的昂贵制约了这些新技术的广泛应用[7] 本次实验采用常用多管发酵法和滤膜法来检测水中大肠菌群。

多管发酵法的优势在于运用广泛，适用于各种水样的检验，不受浊度的影响，可以检验浊度比较大的水样，结果比较稳定，价格便宜，不需昂贵设备滤膜法的优势在于操作简单、快速，非常便于检测大批量的低浊度水样，特别适用于自来水厂作为常规监测之用[8]1 实验部分1.1 实验材料1.1.1 材料来源水样取自微生物学实验室，珍珠湖和柳溪1.1.2 主要的实验仪器与工具SHP-250型生化培养箱（上海三发科学仪器有限公司），DHG-9053A型恒温干燥箱（上海一恒科技有限公司），SW-CJ-IFD型超净工作台（苏净集团安泰公司），GI54DWS型高压灭菌箱（致微（厦门）仪器有限公司），XS-212-201型显微镜（江南江光科学仪器有限公司），YP202N型电子天平（上海精密科技仪器有限公司），海尔冰箱（青岛海尔有限公司），控温电炉，接种环，酒精灯，烧杯，培养皿，三角烧瓶，记号笔，载玻片，盖玻片，双层瓶，擦镜纸，玻璃棒，pH试纸1.1.3 实验药品牛肉膏，蛋白胨，NaCl，乳糖，琼脂，KH2PO4，美蓝，伊红，碘片，95%乙醇，草酸铵，溴甲酚紫，番红，碘化钾，结晶紫，NaOH，HCl1.2 实验方法1.2.1 水样的采取[9]将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧3min后，水流5min，以灭菌三角瓶接取水样备用；在距珍珠湖和柳溪岸边5m处，取距水面10-15cm的水样，将灭菌的具塞三角瓶瓶口向下浸入水中，后翻转过来，除去玻璃塞，水流入瓶中，盛满后，盖好瓶塞，从水中取出，放入4℃冰箱中保存。

1.2.2 培养基的配制[9]1.2.2.1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，倒入1000mL大烧杯中，电炉上加热至完全溶解，定容至1000mL用NaOH或HCl调pH值至7.0-7.2，倒入三角烧瓶中，121°C，灭菌20min1.2.2.2 乳糖蛋白胨培养基:称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，乳糖5 g，倒入1000mL大烧杯中，电炉上加热至完全溶解，后定容至1000mL用NaOH或HCl调PH至7.2~7.4.加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于有发酵管的试管中115°C，灭菌20 min1.2.2.3 伊红美蓝琼脂培养基将100mL已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基加热熔化，冷却至60°C左右时，把已灭菌的2mL 20%乳糖溶液、2mL2%伊红水溶液和1 mL0.5%美蓝水溶液以无菌操作加入，摇匀后，立即到平板1.2.3革兰氏染液[10]的配制草酸铵结晶紫染液：结晶紫2g， 95%酒精20mL，草酸铵0.8g和蒸馏水80mL混合，静置48h后使用；卢戈氏碘液：碘化钾2.0g，碘片1.0g蒸馏水定容至300mL；番红复染液：番红2.5g溶于10mL95%的酒精中，再用80mL蒸馏水混合而成。

1.2.4 水中细菌总数的测定[9]1.2.4.1 自来水样的检测无菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌培养皿中，共做2个将熔化后保温至45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，趁热转动另取一培养皿，不加水样，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照待琼脂凝固后，37℃培养24h，计数1.2.4.2 珍珠湖水样的检测将珍珠湖水样稀释成10-1、10-2、10-3三种稀释度的稀释液，分别吸取1mL于灭菌平皿内，每个稀释度作2个重复将熔化后保温至45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，趁热转动待琼脂凝固后，37℃培养24h，计数，乘以稀释倍数，得1mL水样中的细菌菌落总数1.2.4.3 柳溪河水样的检测柳溪水样稀释成10-2、10-3、10-4三种稀释度，分别吸取1mL于灭菌平皿内，每个稀释度作2个重复将熔化后保温至45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，趁热转动待琼脂凝固后，37℃培养24h，计数，乘以稀释倍数，得1mL水样中的细菌菌落数计算方法如表1-1表1-1 水中菌落总数的测定方法例次稀释度及菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/（cfu/mL）报告方式菌落总数/（cfu/mL）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.6×1042多不可计295461.63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313-313000310000或3.1×105527115-270270或2.7×1026000-＜10＜107多不可计30512-3050031000或3.1×1041.2.5 多管发酵法测定水中总大肠菌群1.2.5.1 自来水样的检测[12]初发酵实验：在2个各装有50mL的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的三角瓶中(内有倒置发酵管)，以无菌操作各加水样100mL。

在10支装有5mL的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵试管中，以无菌操作各加入水样10mL摇匀后，37℃培养24h平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18~24h大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养基发酵试管中，为防止遗漏，每管接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落3个，37℃培养24h，若产酸又产气，证实有大肠菌群存在最后根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表1-2，报告每升水样中的大肠菌群数表1-2 总大肠菌群检数表 012备注每升水样中大肠菌群数012345678＜337111418222731481318243036435111182738527092120161接种水样总量300mL（100 mL2份，10 mL10份）93660230104069＞2301.2.5.2 珍珠湖水样的检测[13] 将珍珠湖和柳溪水稀释成10-1。

分别吸取1mL10-1的稀释度水样和原水样，注入有10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵（内有倒置发酵管）管中另取10mL和100mL原水样分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h以下步骤与上述自来水的平板分离和复发酵实验相同证实有大肠菌群的存在后，将100mL、10mL、1mL、0.1mL 水样的发酵管结果查表1-3，获得每升水样的检测结果 表1-3 总大肠菌群检数表接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1001010.1----＜9接种水样总量为111.1 mL（100，10，1，0.1mL各一份）---+9--+-9-+--9.5--++18-+-+19-++。