
三体综合征产前诊断课件.ppt
18页21三体综合征产前诊断,From 临床17班第三小组,案例,张某,女,31岁,商场收银员,怀孕16周,担心所孕胎儿不正常,前来进行遗传咨询经询问得知,张某的一表姐曾生育一智力低下儿子,经某医院诊断为先天愚型,但具体核型不详张某孕前检查各项优生指标均正常,孕前无感冒服药史,无有毒有害物质接触史张某的丈夫,32岁,司机,有烟酒嗜好,在妻子怀孕前半年已戒酒,减少吸烟量两人核型检查均正常,家族中其他特殊疾病患者根据张某的情况,作中孕期唐氏筛查,结果张某血清的AFP ,hCG 和uE3检查结果阳性根据上述资料和风险评估,张某所孕胎儿具有21三体综合症的高风险,建议进行产前诊断孕妇就诊,,常规筛查,,综合分析风险值,,孕期检查,,进一步确诊,,羊膜穿刺,,,,,荧光原位杂交技术,PCR技术,,,,,,,,结果分析,,遗传建议,羊膜穿刺,离心,实验流程:,,羊膜穿刺---羊水中有一定数量胎儿脱落细胞(多为成纤维细胞和上皮细胞),经体外培养后,可进行染色体分析.酶和蛋白质检测性、染色体检查和提取DNA作基因分析,也可不经培养,用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断时间:妊娠16~20周 步骤:(B超监视下进行)孕妇排空膀胱—腰穿针穿刺—穿过腹壁和子宫 壁进入羊膜腔—抽取羊水,荧光原位杂交(FISH),FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.,材料 仪器 离心机,水浴锅,恒温培养箱,荧光显微镜。
试剂 荧光探针 工作液的配制:(1)20×SSC:氯化钠175g,柠檬酸三钠 88.2g,加三蒸水到1000ml2)变性液:甲酰胺28ml,20×SSC 4ml,蒸馏水8ml,终体积40ml,充分混匀,调整pH至7.0~8.0,密封保 存于4℃~8℃,每次使用前均需测定pH值3)洗脱液:甲酰胺 20ml,20×SSC 4ml,蒸馏水16ml,终体积40ml4)SSCT: 20×SSC 100ml,Tween-20 0.2ml,加二蒸水至终体积为1000ml 方法 1.羊水细胞涂片的制备 抽取羊水5~6ml,1500rpm离心10min,去上清,留羊水细胞沉淀;在细胞沉淀中加3ml 0.25%trypsin(溶于无CaCl2的Hanks液),37℃消化30min;2000rpm离心10min,去上清,在沉淀中加入4~5ml 0.75mol/L KCl,37℃孵育30min,再加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1),轻轻混匀,2000rpm离心10min,去上清,加5ml固定液,轻轻混匀,2000rpm离心10min,去上清,加适量固定液,滴片 2. 杂交、洗脱、显色 (1)将pH为7.0~7.5的变性液(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中预热至74℃,将一支干净的温度计插入变性液中以确认温度达到了74℃,注意冷玻片插入变性液中将降低变性液的温度。
2)将玻片插入预热的变性液中3~4min,不要摇动,然后迅速将玻片插入预冷至-20℃的酒精中,依次从70%、90%到100%酒精中各脱水2min3)将探针于37℃保温5min,轻轻振动后短暂离心收集液体于管底(不要变性探针)4)用刻字笔将标本周围划线,加上10μl探针盖上盖玻片,在盖玻片周围封上一层rubber cement,将玻片置于湿盒中于37℃杂交过夜荧光原位杂交技术,(5)在水浴中预热40ml洗脱液(50%甲酰胺/2SSC)至43℃,将一支 干净的温度计插入洗脱液中证实温度达到43℃ (6)用镊子小心地除去rubber cement,小心揭开盖玻片,将玻片插入 洗脱液中洗脱10min,然后再重复一次洗脱液的温度对于信号强度与特异性非常关键,洗脱液温度不能低于43℃以免由于交叉杂交导致背景产生 (7)将玻片在37℃的2×SSC中洗脱2次,每次4min (8)将玻片置于室温SSCT液中洗脱2min (9)将玻片取出,用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT,不要让玻片干掉,以免由于检测试剂的非特异性结合导致高背景荧光 (10)在每块玻片上加上30μl avidin-FITC,盖上盖玻片,37℃孵育20min。
(11)小心去除盖玻片,将玻片在室温SSCT中洗脱3次,每次2mi (12)用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT,加上30ml Anti-avidin于标本上,盖上盖玻片,37℃孵育20min (13)小心去除盖玻片,在室温的SSCT中洗脱3次,每次2min (14)在每块玻片上加上30μl avidin-FITC,盖上盖玻片,37℃孵育20min (15)小心去除盖玻片,在室温的SSCT中洗脱3次,每次2min (16)用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT加上10μl DAPI,盖上18mm×18mm盖玻片,用一块纸巾盖上盖玻片,小心挤压纸巾以吸去多余的DAPI,注意不要移动盖玻片 3.荧光显微镜下观察.,,,如图:显示两红两绿的荧光即为正常.,,,如图:显示三红两绿即为患者PCR-SSLP技术,选用21号染色体的6个具有高度多态性的短串联重复序列(STR)位点为遗传标记,应用pcr—sslp技术,通过pcr扩增和硝酸银进行检测 方法步骤:取羊水2ml------处理离心-----沉淀保留DNA pcr 扩增:配置扩增体系,调整pcr循环参数 电泳分离 银染 -显色 -扩增产物检测,结果 正常人在某一str位点可出现两种情况: 一.若为杂合子,pcr产物电泳结果显示2条DNA带,密度定量为1:1. 二.若为纯合子,pcr产物电泳结果显示1条DNA带。
Down综合征患者在某一str位点的检测结果分3种情况:一,显示为3条DNA带,密定量比为1:1:1 ;二,显示为2条DNA带,密度定量比为2:1;三,显示为1条DNA 前两种提示:该str位点有3个等位基因,可对DOWN综合征作出诊断 第三种提示:三个等位基因纯合型,不能做出诊断,需结合其他STR位点的检测结果综合分析 本研究选6个STR位点分布于21号染色体长臂;D21S16位于21q11.1,D21S11位于21q22.1~q21;D21S1432位于21q21;D21S1437和D21S1270位于DSCR(关键区域)内部,D21S1446位于21q23.30因此,选用上述6个STR位点,尤其是D21S1437,D21S1270两位点位于DSCR内部,以它们作为遗传标记,采用PCR—SSLP的方法结合定量分析,可以确认,细胞中21号染色体的数目或DSCR的数目,从而对由21三体及部分三体造成的DOWN综合征作出诊断先天愚型染色体核型分析,核型特征 一、 若结果正常: 核型:46,XX(XY) 二、若结果异常: 1、21三体型(约占92.5%): 有典型的临床表现 核型:47,XX(XY),+21,,产生原 因: 父母之一配子发生时减数分裂过程中出现不分离的结果,大多数是母亲卵子形成过程中发生了21号染色体不分离(95%);父亲精子形成中发生21不分离而致该病约占5%。
2、易位型(约占5%): 有典型的临床表现 常见核型: 46,XX(XY),-14,+t(14;21)(p11;q11),,3、嵌合型(约占2.5%): 临床症状可以很典型,也可以很轻,主要取决于正常细胞与异常细胞之间的比例 核型: 46,XX(XY)/47,XX(XY), +21 原因:正常的受精卵在胚胎发育早期卵裂过程中,发生21号染色体的不分离综上总结给与遗传建议: 若经过实验检查诊断为21三体综合症,就目前的医疗水平而言,21-三体综合征既没有方法治愈也没有方法预防,目前主要通过药物减轻某些症状,通过加强训练使患儿生活自理并能从事某些有益劳动,从而减轻家庭和社会的负担,鉴于该女性还年轻,身体状况也较好,建议该孕妇不宜生育该患儿thank you,。












