药学绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析.doc

XX大学毕业论文绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析2014年6月25日绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析作者：陈波曼余加林刘官信胡琳燕李芳杨华【摘要】 目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm, BF)形成发展过程中 空间立体结构变化，以及BF形成过程中与其生物学行为之间的相互联系方法 体外建立6h和1、3及6d等4个时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型，通 过绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)标记，结合激光共聚焦显微镜 (confocal laser scanning microscopy, CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的 图片堆，经图像结构分析软件(image structure analyer, ISA)分析获得PAO1菌株 BF相关空间结构参数定量化数据结果 ①CLSM结合GFP标记，实现了对PAO1 菌株BF动态形成过程的观察；②ISA软件定量化分析显示，随着BF发展，厚 度不断增加，前3d增加程度(19.6pm)明显大于后3d(6.1(im),区域孔率(areal porosity, AP)、平均扩散距离(average diffusion distance, ADD)和结构炳(textural entropy, TE)在BF形成的6h和6d分别为：0.980.01和0.920.02,呈现下降趋 势；1.000.009和1.060.027,虽变化幅度不大，但亦呈现逐渐增加趋势；0.70.08 和4.30.09,呈明显上升趋势。

结论ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空间结 构特征，对细菌BF结构的定量化分析也有助于探索BF形成过程与其生物学行 为之间的相互联系关键词】 生物膜；铜绿假单胞菌；定量分析；结构ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. (2)The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6j.im vs. 6.1pm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.980.01 at 6h to 0.920.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.000.009 at 6h to 1.060.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.70.08 at 6h to 4.30.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure长久以来，人们对细菌的认识停留在浮游态水平上，但自然界中99%的细 菌以生物膜(biofilm, BF)的形式存在。

细菌BF是细菌为适应生存环境黏附惰性 或活性材料表而形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，具有环境适应能力更 强，抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐药性极强等生物学特性，而BF 的许多特性均与其特殊形态结构有关铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, Pa)是我国医院和社区获得性感染及重症监护病房感染的重要条件致病菌，近年 来研究证明，该菌极易形成BF [1],临床上，有BF表型的Pa往往引起难以治 愈的严重感染以往研究多采用光镜、扫描或透射电镜等观察细菌BF结构，但 样本在脱水、固定、染色等处理过程中易发生结构扭曲及关系改变本实验通过 建立体外PaOl菌株BF模型，结合绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，运用激光共聚 焦显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)摄取BF发展成熟各阶段不 同层面的图像，所获图片堆经图象结构分tJT（imagc structure analycr, ISA）软件分 析，获得PAO1菌株BF发展过程相关空间结构变化的数据，以期实现对细菌BF 的无损伤观察，并对BF空间结构的定量化分析进行了初步探索。

1材料和方法1.1试剂和菌株铜绿假单胞菌PAO1菌株（本实验室保存），pGFPuv质粒（Clontech公司）， 质粒DNA小量提取试剂盒（日本BioFlux公司），限制型内切酶EcoRT和HindIII（宝 生物公司），ISA软件（美国Montana州立大学Haluk Bcycnal教授提供）⑴PAO1菌株电感受态制备 参考单志英等［2］实验方法，将过夜增菌的 PAO1菌株转接于50ml SOB培养基中，37C, 200r/min振荡培养；A600值为0.7 左右口寸中止培养；2C, 6000r/min离心15min；菌体沉淀依次用等体积、1/2体 积、1/5体积的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新悬浮，洗涤菌体；2C, 6000r/min离 心15min,最后根据菌体多少加入不同体积的0.3mol/L蔗糖溶液将菌体混匀；分 装成每管100m，直接用于电转化2） pGFPuv质粒转化和转化菌株筛选感受态细胞100）11,质粒约50ng, 加入预冷的0.1cm电转化杯中；在Bio Rad电转化仪上（设置电压1.5kv,电容 25gF,电阻200进行电击5ms；将转化体系加入37C温浴的800pl SOC培养基 中，37C, 100r/min振荡复苏lh；取100四1菌液涂布筛选培养基，37C, 16h〜 18h；在筛选培养基上生长，且紫外灯下有绿色荧光的菌落即为实验需要的转化 菌株。

3） 转化菌株中质粒提取和酶切电泳鉴定挑取表达强绿色荧光的转化菌 株单菌落，接种L Broth培养液，37C振荡培养过夜；按照BioFlux公司质粒 提取试剂盒产品说明进行质粒的小量提取；0.8%琼脂糖凝胶电泳；对照pGFPuv 质粒图谱进行鉴定用EcoRI和Hindlll行双酶切，反应温度为37C；反应体系 为 Hindlll IgL EcoRI IgL 10xM 缓冲液 2pl,提取质粒 17|.il,作用 12h； 0.8% 琼脂糖凝胶电泳4) pGFPuv转化菌株建立BF模型 挑取GFP转化PAO1菌株单菌落接种 L Broth培养液，37C, 180r/min振荡培养过夜；调整A600值至0.5；接种PAO1 菌液于预先放置灭菌盖玻片(8mmx8mm，作为黏附载体)的24孔细胞培养板中， 每孔1ml； 37C,分4个不同时7可段6h、Id、3d、6d孵育，隔日换液，每个时 间段重复5次1.2激光共聚焦显微镜观察氯激光(488nm)激发，物镜、20,每个模型由外(BF游离的一面)向内(BF和 玻片相贴的一面)逐层扫描(沿Z轴扫描)，每个标本扫描8〜16张1.3运用ISA软件对PAO1菌株BF结构定量化分析将上述获得的各时间组模型图片堆调入ISA3D软件，确认图片的完整性 及顺序后运行ISA及ISA3D命令，运行结果包括：①结构参数：如结构炳(textural entropy, TE)、结构能(energy, E)、均一，^(homogeneity, H)；②平面参数：区 域孔率(areal porosity, AP)、平均扩散距离(average diffusion distance, ADD)、最 大扩散距离(maximum diffusion distance, MDD)等指标；③其它参数：如生物量 (biovolume, BV)> 比表面积(surface area between biomass and void, SA)、单位面 积生物膜体积(biomass volume to surface area ratio, V2SA)等［3］。

输出数据以 EXCEL格式保存2结果2.1 GFP标记的PAO1菌株构建与发光表型观察通过电转化方法对PAO1菌株进行了 pGFPuv标记转化菌株自然光下即 可见绿色荧光，在紫外灯下发出强绿色荧光；荧光显微镜下，转化菌株菌体发出 明亮的绿色荧光，细菌形态呈短棒状，提示pGFPuv已经成功转入了 PAO1菌株 中，该转化菌株可以作为BF空间结构定量化分析研究的模式菌2.2转化菌株质粒提取鉴定及双酶切鉴定转化菌株抽提质粒后，电泳结果显示在2000和3500bp之间有一条约 3300bp带，条带与质粒大小吻合提取的质粒进行EcoRI和Hindlll双酶切，电 泳显示在2000和3500bp之间有一条约2500bp带，在500和lOOObp之间有一条 约800bp带，与预期结果吻合，提示pGFPuv己成功转入PAO1菌株，并以游离 质粒形式表达2.3 CLSM观察GFP标记BF模型6h左右，PAO1己经。