单向免疫扩散试验.ppt

单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验1 1•沉淀反应（沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应相应抗体特异性结合所出现的反应•1905 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 1946 试管免疫扩散技术试管免疫扩散技术 1965 单向免疫扩散技术单向免疫扩散技术 1967 散射比浊法散射比浊法2 2•在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在抗原原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在抗原抗体比例合适区域内形成可见的沉淀环抗体比例合适区域内形成可见的沉淀环抗原抗体反应时，只有其中一种成分发生抗原抗体反应时，只有其中一种成分发生扩散）扩散）•根据试验形式可分为试管法和平板法两种根据试验形式可分为试管法和平板法两种3 34 4•测量沉淀环的直径或计算环的面积沉淀测量沉淀环的直径或计算环的面积沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系同时，这种是直线相关，而是对数关系同时，这种沉淀环与分子量和扩散时间有关。

沉淀环与分子量和扩散时间有关5 5•试剂与器材试剂与器材1.羊抗人羊抗人IgG诊断血清诊断血清2.人人IgG标准液（标准液（30g/L））3.待测人血清待测人血清4.琼脂粉琼脂粉5.生理盐水生理盐水6.载玻片载玻片(玻璃板）、三角烧瓶、吸管、加样玻璃板）、三角烧瓶、吸管、加样器、打孔器、水浴箱、湿盒、直尺等器、打孔器、水浴箱、湿盒、直尺等6 6•操作方法操作方法1.制备琼脂凝胶制备琼脂凝胶 （（1）生理盐水配制琼脂凝胶（）生理盐水配制琼脂凝胶（15g/L），煮沸），煮沸溶化至澄清，置溶化至澄清，置56℃水浴中备用水浴中备用 （（2）取适量溶化琼脂，以琼脂）取适量溶化琼脂，以琼脂∶ ∶抗体＝抗体＝4 ∶ ∶1比比例吸取相应抗体，与琼脂充分混合，置例吸取相应抗体，与琼脂充分混合，置56℃水浴中备用水浴中备用7 7•2.制板制板 （（1）取洁净干燥玻片，置于水平台上）取洁净干燥玻片，置于水平台上 （（2）用吸管吸取）用吸管吸取4ml琼脂（含抗体），于琼脂（含抗体），于载玻片载玻片1/3处浇注，使琼脂凝胶均匀铺满玻处浇注，使琼脂凝胶均匀铺满玻片，不要留有气泡片，不要留有气泡 3.打孔打孔 待琼脂凝固后，用直径待琼脂凝固后，用直径3mm的打的打孔器打孔，孔距孔器打孔，孔距10～～12mm8 8•4.加样加样 用微量加样器吸取待检血清用微量加样器吸取待检血清10μl,加入相应加入相应的试验孔中，做好标记。

的试验孔中，做好标记 将人将人IgG标准液（标准液（30g/L）用生理盐水分别）用生理盐水分别做如下稀释：原倍做如下稀释：原倍，， 1:2，， 1:5，， 1:10，， 1:20，， 1:30，，用微量加样器吸取稀释标准液用微量加样器吸取稀释标准液10μl,加入相应的试验孔中，做好标记加入相应的试验孔中，做好标记 9 9•5.扩散扩散 将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内，置将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内，置37℃24h后观察结果后观察结果 1010•结果判断结果判断 精确测量各试验孔沉淀环的直径，以沉淀精确测量各试验孔沉淀环的直径，以沉淀环直径为横坐标，相应孔中环直径为横坐标，相应孔中IgG含量的对数含量的对数为纵坐标，绘制标准曲线为纵坐标，绘制标准曲线logC/d=K)1111•注意事项注意事项1.玻片须干燥、洁净，边缘无破损置水平玻片须干燥、洁净，边缘无破损置水平处2.浇制琼脂板时动作要匀速浇制琼脂板时动作要匀速3.打孔时避免水平移动打孔时避免水平移动4.加样时避免气泡或加至孔外，加样要准确加样时避免气泡或加至孔外，加样要准确5.应同步绘制标准曲线应同步绘制标准曲线6.抗血清与溶化琼脂混合时，温度应控制在抗血清与溶化琼脂混合时，温度应控制在56℃℃1212。