植物组织中超氧化物歧化酶活性测定课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验五 植物组织中超氧化物歧化酶活性测定,指导老师：王小燕,一、实验原理,超氧化物歧化酶（,superoxidedismutase,SOD,）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：,2O+2HHO+O,本反应产物,HO,可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（,NBT,）在光下的还原作用来确定酶活性大小在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在,560nm,处有最大吸收而,SOD,可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高据此可以计算出酶活性大小二、材料、仪器设备及试剂,（一）材料 水稻或小麦叶片二）仪器设备 高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为,4000lx,），试管或指形管数支三）试剂（,1,）,0.05mol/L,磷酸缓冲液（,pH7.8,）。

2,）,130mmol/L,甲硫氨酸（,Met,）溶液：称,1.9399gMet,用磷酸缓冲液定容至,100ml,3,）,750mol/L,氮蓝四唑溶液：称取,0.06133gNBT,用磷酸缓冲液定容至,100ml,，避光保存4,）,100mol/LEDTA-Na2,溶液：称取,0.03721gEDTA-Na2,，用磷酸缓冲液定容至,1000ml,5,）,20mol/L,核黄素溶液：称取,0.0753g,核黄素用蒸馏水定容至,1000ml,，避光保存三、实验步骤,1,、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）,0.5g,于预冷的研钵中，加,1ml,预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为,5ml,取,1.5,2ml,于,1000r/min,下离心,20min,，上清液即为,SOD,粗提液2,、显色反应 取,5ml,指形管（要求透明度好）,4,支，,2,支为测定管，另,2,支为对照管，按下表加入各种溶液：各溶液显色反应用量,混匀后将,1,支对照管置暗处，其他各管于,4000lx,日光下反应,20min,（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）3,、,SOD,活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。

四、结果计算,已知,SOD,活性单位以抑制,NBT,光还原的,50,为一个酶活性单位表示，按下式计算,SOD,活性SOD,总活性 式中：,SOD,总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；,A,为照光对照管的吸光度；,A,为样品管的吸光度；,V,为样品液总体积,ml,，,V,为测定时样品用量,ml,；,W,为样鲜重,g,；蛋白质含量单位为,mg/g,The end.,。