棉籽粕及棉籽蛋白中游离棉酚含量检测.ppt

棉籽粕及脱酚棉籽蛋白中游离棉酚含量的检测,袁勇,1、棉籽粕及脱酚棉籽蛋白饲料 2、棉籽粕及脱酚棉籽蛋白在饲料中使用的局限性 3、棉籽粕及脱酚棉籽蛋白加工工艺 4、游离棉酚常用的检测方法介绍 5、GB 13086-91游离棉酚检测原理及标准方法介绍 6、应用GB13086-91测定饲料中游离棉酚注意事项,目录,一、棉籽粕及脱酚棉籽蛋白,棉籽饼粕是棉籽榨油后的副产物压榨取油后的称饼， 预榨浸提或直接浸提后的称粕棉籽经脱壳后取油的副产物 称棉仁饼粕，在我国是仅次于大豆粕的一种重要蛋白质资 源脱酚棉籽蛋白是棉油加工的副产品，由于采用了先进的加 工工艺，其棉酚含量一般小于0.04%，蛋白质含量50％以 上，消化率高于普通棉粕，是一种优质蛋白质原料棉籽饼粕的营养价值相差很大，影响棉籽饼粕营养价值 的主要因素是棉籽脱壳程度及制油方法壳的粗蛋白含量 5%-10%，完全脱壳的棉仁制成的棉仁饼粕粗蛋白质可达55 ％，而由不脱壳的棉籽直接榨油生产出的棉籽饼粗纤维含量 达16％-20％，粗蛋白质仅20％-30％而不同取油方法由于 饼粕中脂肪含量不同致使粗蛋白质含量有一定的差异一般 饼的脂肪含量高，有效能值高，粗蛋白质含量较低；粕中脂 肪含量低，有效能值低，粗蛋白质含量高。

二、 棉籽粕及脱酚棉籽蛋白饲料在饲料使用的局限性,棉籽饼粕蛋白质组成不太理想，精氨酸含量高达3.6％- 3.8％，而赖氨酸含量仅有 1.3％一l.5％，只有大豆饼粕的一 半蛋氨酸也不足，约0.4％同时，赖氨酸的利用率 较差 故赖氨酸是棉籽饼粕的第一限制性氨基酸饼粕中有效能 值主要取决于粗纤维含量，即饼粕中含壳量维生素含量受 加热损失较多矿物质中含磷多，但多属植酸磷，利用率低 棉籽粕中含有棉酚、环丙烯脂肪酸、植酸等抗营养因 子，其中棉酚对动物危害最大，因而最受关注棉酚以游离 态和结合态两种形式存在，“结合棉酚”是棉酚在高温蒸炒过 程中，游离棉酚与棉仁中的蛋白、糖类结合而成的，它在消 化道中不被吸收，可随粪排出体外，毒性较低；“游离棉酚” 则是具有活性醛基和羟基的棉酚，其毒性较大，是一种细胞 性、血管性、神经性毒物，含量超过安全界限，将导致动物 生长迟缓、中毒与死亡，普通棉籽中含有0.7%~4.8%的棉酚脱酚棉籽蛋白 一、棉籽脱酚的方法及其优缺点 1.1 化学法用化学法脱除棉籽粕中的棉酚，主要是在已经过预榨 提油的棉粕中添加硫酸盐（硫酸亚铁、硫酸铜），其金属离 子与粕中游离棉酚形成络合物，达到脱毒目的。

但是所形成 的络合物仍保留在棉粕中，粕的营养价值和适口性都比较差 1.2．生物发酵法采用微生物发酵的方法将棉粕中的棉酚转化为其他物 质，达到脱毒的目的由于转化机理不明，工艺条件的控制 难度大，脱毒效果无法保证其使用的原料是热榨浸出后的 棉粕，在整个工艺处理过程中，粕中蛋白质严重变性和破 坏，营养价值无法得到保证此外，菌种提纯复杂、投资大 、成本高以上两种方法仅强调了脱除棉酚，却忽视了棉粕 营养效价的保护，使其使用价值和经济效益大受影响1.3 混合溶剂萃取法溶剂萃取法是利用棉酚在醇类溶剂中的溶解特性，采 用两种溶剂混合后（轻汽油和乙醇或丙酮加水）从棉仁中同 时提取棉油和棉酚混合溶剂法是在国内研究比较多的溶剂 萃取方法，其存在的问题是溶剂分离和回收困难（溶剂互溶 及共沸现象严重），溶剂消耗大，成本高；溶剂配比复杂， 且混合溶剂法萃取出的毛棉油中含有大量的棉酚和色素，这 使得油品质量下降，无法形成工业化生产 1.4液-液-固萃取法光棉籽经过清理去杂后剥壳，通过筛选进行仁、壳分 离，得到的棉仁经低温软化、压坯、成型、烘干后，进人浸 出提油系统，经溶剂提取油脂后，湿粕进入脱酚浸出器，再 经溶剂两次萃取使棉酚含量达到工艺要求，脱去溶剂后，进 行低温烘干，最后得到含棉酚量小于0.04%（能达到小于 0.02%）、蛋白质含量大于50%棉籽蛋白成品。

液-液-固萃取 脱酚棉籽蛋白技术既具备了溶剂萃取法的优点（避免了蛋白 质的热变性和氨基酸与游离棉酚的结合），又解决了溶剂萃 取法中溶剂分离和回收存在的问题二、脱酚棉籽蛋白的营养价值 2.1 脱酚棉籽蛋白的氨基酸组成传统方法压榨得的棉籽饼粕，由于过热作用，造成赖 氨酸、蛋氨酸及其它必需氨基酸被破坏，利用率很低，尤其 是游离棉酚会与赖氨酸的ε-NH2结合，发生褐变反应，从而 大大降低赖氨酸的有效成分，因此赖氨酸是棉籽饼粕的第一 限制性氨基酸由表1可以看出，脱酚棉籽蛋白中赖氨酸、 蛋氨酸等氨基酸均较普通棉粕有很大幅度提高，其中赖氨酸 提高40%以上，蛋氨酸+胱氨酸提高近50%；与豆粕相比， 脱酚棉籽蛋白中除赖氨酸和异亮氨酸外其他氨基酸含量均持 平或高于豆粕；与蛋白含量高且氨基酸较平衡的鱼粉相比， 脱酚棉籽蛋白中精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸含量持平或超过 鱼粉水平，但其他氨基酸水平仍然低于鱼粉棉籽粕、脱酚棉籽蛋白和豆粕、鱼粉的氨基酸组成(% 干物质),饲料价值 1、对鸡的饲料价值 其饲料价值在很大程度上取决于游离棉 酚的含量家禽对游离棉酚的敏感性比猪低，一般蛋鸡育成 期饲料中可用至9%，产蛋鸡可用至6%，蛋鸡饲料中游离棉 酚含量若在120-200mg/kg，即不会影响产蛋率。

如要避免 蛋黄在贮存期间脱色，则应限制在60mg/kg以下，否则蛋鸡 在贮存期间卵白及蛋黄可能变成粉红或暗红色亚铁盐的添 可增加鸡对棉酚的耐受性，铁在小肠内与游离棉酚形成复杂 化合物而阻止了小肠对棉酚的吸收，一般所用硫酸亚铁的量 为游离棉酚含量的4倍，此时蛋鸡饲料中游离棉酚量可达 150mg/kg，也不至于使蛋黄变色肉用仔鸡对饲料中棉酚 耐受量为150mg/kg，加铁盐后可增至400mg/kg 竞争厂家产品对比中发现：东方希望集团肉鸡料中铁离子含 量很高，铁离子含量是大成产品中4倍以上2、对猪的饲料价值 品质优良的棉籽粕，可取代猪饲料中半 量的大豆粕而无不良影响，在配合比例上以不超过10%为宜 同时注意补充赖氨酸、钙及胡萝卜素等，猪饲料中游离棉酚 含量由0.01%增至0.02%时对生长有所影响猪对游离棉酚 耐受量为100mg/kg，超过会抑制生长，并可能中毒死亡 添加铁盐之功效、用法同鸡项但有实验表明，硫酸亚铁与 赖氨酸同时加入饲料中，会形成两种以上的复杂化合物而降 低效果三、棉籽粕及脱酚棉籽蛋白加工工艺,棉籽粕,脱酚棉籽蛋白,光棉籽,棉籽脱绒,棉绒,棉壳,棉籽,棉壳,棉籽粕加工工艺,,棉花（籽棉）,棉籽,皮棉,棉仁,压榨,棉饼,浸提,棉粕,棉壳,棉油,精炼,,,,,,,,,,轧花,脱绒、剥壳,焙炒,,,,,,棉籽蛋白的生产加工工艺,四、游离棉酚检测方法介绍,游离棉酚检测方法主要有：间苯三酚法、高效液相色谱法 和苯胺法。

其中苯胺法测定棉酚操作较繁琐，条件较难控制 ；高效液相色谱法虽然重现性好、精确度高，但仪器设备昂 贵，操作复杂，难以在一般生产企业中推广应用；间苯三酚 法测定游离棉酚所需仪器少，具有操作简便、条件要求低、 回收率高一）、间苯三酚法,1 材料与方法 1.1 试剂及仪器 主要试剂：棉酚标准品，间苯三酚（分析纯）、丙酮（分析 纯）、盐酸（分析纯），95%乙醇（分析纯） 主要仪器：容量瓶、分光光度计、 恒温振荡器1.2 方法 1.2.1 棉酚标准曲线的绘制棉酚标准溶液的配制：准确称取0.050 g 醋酸棉酚，溶于 70 %丙酮溶液溶解并定容至50 ml 取此溶液10ml于100ml 容量瓶中用70%丙酮溶液定容到100ml，溶稀释10 倍，相当 于每毫升应用液中含棉酚0.1 mg显色剂配制：准确量取 16.6 ml 浓盐酸，置于100 ml 三角瓶中，加入1g 间苯三 酚，加95%乙醇至100 ml，溶解后混合置于棕色瓶中放入冰 箱备用准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8 ml 棉酚标准液并依次编 号为1～5 号放入10 ml 试管中，再依次分别加入1、0.8、 0.6、0.4、0.2 ml 的70 %丙酮溶液，各试管中加入2 ml 的 显色剂，摇匀，在50～55 ℃恒温水浴箱中加热5 min。

用1 cm 比色皿，以70 %丙酮溶液调零，在550 nm 波长处测定 吸光度值不同浓度棉酚标准液吸光度值,根据棉酚含量（mg）与吸光度值进行回归计算，得回归方程为：y=0.0466x-0.0013(R2=0.9956)，并绘制标准曲线1.2.2 样品的处理方法与测定棉粕用万能粉碎机粉碎完全通过40目筛后作为样品，分 别准确称取4～5g样品，置于具塞锥形瓶中，分别加入约40ml70%丙酮溶液，盖上瓶塞，于恒温振荡器上振荡1.5小 时，静置，用中速滤纸过滤于50ml容量瓶中，丙酮溶液洗 涤并定容至50ml然后分别取滤液1ml 置于试管中，各加 入2ml 显色剂摇匀，测定方法与标准曲线绘制步骤相同每 个样品分别做2个重复，取其平均吸光度值，并根据棉酚标 准曲线推算出棉粕样品中棉酚的含量二）、液相色谱法（ 外标法定量）,1、原理概要试样中的棉酚用丙酮水溶液提取，过滤，定容，过0.5μm 微孔滤膜后，用高效液相色谱仪测定，外标法定量 2、主要试剂和仪器 2.1.主要试剂丙酮（分析纯）；甲醇（色谱纯）；磷酸（优级纯）：85%；丙酮水溶液：70%(V/V)；棉酚标准品：纯度≥99%；棉酚标准储备液：准确称取50mg棉酚标准品，溶于丙酮 水溶液中，移入棕色容量瓶中并稀释定容至50mL，保存于冰 箱中，该液1mL相当于1mg棉酚；棉酚标准工作液：准确吸取0.5mL棉酚标准储备液于50mL 棕色容量瓶中，用丙酮水溶液定容，保存于冰箱中，该液1mL 相当于10μg棉酚。

2.2.仪器高效液相色谱仪，配有紫外检测器；旋涡混匀器或超声波提取器；棕色容量瓶：50mL；锥形瓶：100mL，具塞；微量进样器：25uL；微孔滤膜：0.5um 3、试样的抽取与制备 3.1.检验批以不超过2000件为一检验批同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等3.2.抽样数量批量，件 最低抽样数，件1～500 15501～1000 25 1001～2000 30 3.3.抽样方法按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启从每件中至少抽取500g作为原始样品原始样品总量不得少于2kg放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室3.4.试样制备将取回的原始样品充分混匀，用四分法缩分出约500g， 用小型粉碎机粉碎，使全部通过直径为2mm的孔筛充分混 匀，均分成两份试样，分别装入清洁容器内，加封后，标明 标记 4.操作过程 4.1.提取和净化称取试样约5g(精确到0.01g)于100mL锥形瓶中，加15mL丙酮水溶液，在旋涡混匀器或超声波提取器上提取5min将提取液过滤至50mL棕色容量瓶中，用15mL丙酮水溶液重复提取一次，过滤。

用少量丙酮水溶液洗残渣，过滤，合并滤液并用丙酮水溶液定容静置5min，取上清液过0.5μm微孔滤膜，供高效液相色谱测定4.2.测定 4.2.1.液相色谱条件色谱柱：ODS-C18柱，300mm×3.9mm(id)，粒度10um；流动相：甲醇-水(85＋15)，每100mL溶液加0.1mL磷酸(85%)；流速：0.8mL/min；测定波长：236nm；柱温：室温；进样量：20uL 4.2.2.液相色谱测定根据样液中棉酚含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液 标准工作溶液和样液中棉酚响应值均应在仪器检测线性范围 内对标准工作溶液和样液等体积穿插进样测定在上述色谱 条件下，棉酚保留时间约为9.2min4.3.空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行 5.结果计算用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中棉酚含量：X＝ c·h·V/ hs·m 式中： X——试样中棉酚的含量，mg/kg；h——样液中棉酚的峰高，mm；hs——标准工作溶液中棉酚的峰高，mm；c——标准工作溶液中棉酚的浓度，ug/mL；V——样液定容体积，mL；m——称取的试样量，g 注：计算结果需扣除空白值。