Urocortin 致大鼠心肌细胞肥大由PKA信号通路介导.doc

1Urocortin 致大鼠心肌细胞肥大由 PKA 信号通路介导作者：梁春光，王洪新，刘春娜，刘杰,黄雷【摘要】 目的 通过观察 PKA 拮抗剂 H-89 和 CRF 受体拮抗剂 Astressin 抑制UCN 诱导乳大鼠心肌细胞肥厚的作用，研究 UCN 诱导的大鼠心肌细胞肥厚的信号转导机制方法 以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型，应用 UCN 0.1 μmol·L-1诱导心肌肥大，观察 H-89 0.1 μmol·L-1 和 Astressin 1 μmol·L-1 的作用，探讨 UCN 0.1 μmol·L-1 对心肌肥厚的作用机制用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积；［3H］亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白的合成；用 Western 蛋白印迹法测定 ANP 表达结果 UCN 0.1 μmol·L-1 使心肌细胞体积、蛋白合成和 ANP表达明显增加，H-89 0.1 μmol·L-1 和 Astressin 1 μmol·L-1 抑制 UCN 诱导的心肌肥大结论 Urocortin 可能通过 CRF-R2 并通过 PKA 信号通路诱导乳大鼠心肌细胞肥大 【关键词】 Urocortin 心肌肥大 PKA H-89Abstract: Objective To observe the inhibitive effects and signal transduction by H- 89 and CRF receptor antagonist Astressin on hypertrophic myocardial cells induced by UCN in neonatal rats and study the signal transduction mechanism of hypertrophic myocardial rats induced by UCN. Methods Using the myocardial cells of neonatal rats cultured in vitro as models, and inducing myocardial hypertrophy by using UCN 0.1 μmol·L-1 to observe the effect of H-89 0.1 μmol·L-1 and Astressin 1 μmol·L-1 and discuss the mechanism of effect of UCN 0.1 μmol·L-1 on myocardial hypertrophy. The cardiomyocytes volumes were measured by computer photograph analysis system. The protein synthetic rate was obtained through measuring the incorporation of [3H]- leucine into myocyte protein by liquid scintillation method. The expression of ANP was determined by western-blot. Results UCN enhanced the cardiomyocyte volume, the synthesis and the expression of ANP. H-89 0.1 μmol·L-1 and Astressin 1 μmol·L-1 can inhibit myocardial cells hypertrophy induced by UCN. Conclusions The hypertrophic effect of UCN in neonatal rats' cardiomyocytes is mediated via CRF-R2 2and activation of the PKA pathway.Key words：Urocortin; myocardial cells hypertrophy; PKA; H-89Urocortin(UCN)是在 1995 年新发现的一个神经肽，研究发现 UCN 在心脏中［1］有表达，是一个很重要的心血管活性肽。

UCN 可以使新生大鼠心肌细胞 ANP和 BNP 分泌显著增加［2］，而且 UCN mRNA 在肥大心肌上的表达数量明显比在正常心脏上的表达数量高［3］，均说明 UCN 参与心肌肥大作用UCN 与 CRF-R2具有很高亲和力［4，5］，实验表明 UCN 能够使心肌细胞内 cAMP 积聚增加［2］300大量实验也表明 PKA 信号通路参与心肌肥厚作用 为了进一步探讨 UCN 诱导心肌肥厚的作用机制，本研究在 UCN 体外诱导心肌肥大基础上，重点观察应用 PKA 抑制剂 H-89 和 CRF-R 拮抗剂 Astressin 对心肌肥大的影响1 材料与方法1.1 实验动物生后 2～3 d 的 SD 乳大鼠，雌雄不拘，由辽宁医学院试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2003-00071.2 药品与试剂胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、DMEM 培养基、Urocortin、H-89(PKA 抑制剂)、Astressin（CRH 受体拮抗剂）均为美国 Sigma 公司；小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司；［3H］亮氨酸为上海原子核研究所产品；ANP 一抗：Millipore 公司；其他试剂均为分析纯。

31.3 体外乳大鼠心肌细胞培养在无菌条件下，取生后 2～3 d 的 SD 大鼠心脏，放入 Hanks 液冲洗 3 次后，剪成约 1 mm3 的小碎块，用 0.8 g·L-1 胰蛋白酶消化分离细胞，向分离的细胞中加人 15％的小牛血清，84％的 DMEM 培养基，1％的双抗液(含 1×10 U·L-1 青霉素,100 μg 链霉素)的培养基，及 0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿苷，吹打均匀后以 1×109·L-1 的密度接种于 24 孔培养板，送入通以 5%CO2 及 95%空气的二氧化碳孵箱中培 养1.4 分组及给药方法常规培养心肌细胞 2 d 后，换液，为了减少血清成分对实验结果的影响，换液时更换含 0.4％小牛血清的培养基及各种浓度的试剂设对照组，其他组分别加入 UCN(0.1 μmol·L-1)；H-89（10 μmol·L-1）；H-89 + UCN ； Ast（1 μmol·L-1)；Ast+UCN 给药 48 h 后进行各项指标的测定1.5 培养心肌细胞体积测量 细胞体积是通过测量细胞直径获得的用 D-Hanks 液快速冲洗长满细胞的培养孔 3 次，每孔加 0.3 mL 胰蛋白酶（1 g·L-1），放入 37 ℃恒温箱中 30 min 后，再加入 0.2 mL 含有体积分数为 0.1 血清的培养基终止消化，收集细胞注入一细胞室内（该细胞室底部是一经硅化的盖玻片，以防心肌细胞贴壁），在放大 400 倍的倒置显微镜下观察其细胞，几乎均呈球形。

用计算机 CIAS 大恒细胞图象分析系统测量单个细胞的直径，进而计算出细胞的体积每孔随机选择 4 个视野，每个视野测 20 个细胞［6］1.6 培养心肌细胞蛋白质合成的测定4培养 48 h 后更换含有 1 μCi［3H］-leucine 及各种浓度试剂的培养基，一起培养72 h 后倒掉培养液，用冷 Hanks 液快速洗 3 遍，每孔加入 1 mL 10 g·L-1SDS 溶解细胞，用 1 mL 50 g·L-1 的 trichloroacetic acid（TCA）沉淀蛋白，应用 GF/C 过滤，用 5 mL Hanks 液冲洗 3 遍，烘干滤膜，置于 4 mL 闪烁液(体积分数为 4×10-3PPO的二甲苯溶液)的闪烁杯中用液闪仪测量［3H］leucine 的结合，进行蛋白合成的分析［7］1.7 WESTERN BLOT 测 ANP 水平细胞加药作用 48 h 后，用细胞刮刀刮下细胞，用 PBS 冲洗下来，1 000 转/分，15 min，弃上清，把细胞沉淀置于-70 ℃冰箱备用，测定指标时，取出样品放入RIPA 缓冲液，并加入 10 mg/mL PMSF(Santa Cruz Biotechono1ogy，California，USA)，超声裂解后离心提取上清液。

BCA 法进行蛋白浓度测定(Pierce Biotechnology，Inc.IL，USA)分取 50 μg 加等体积的 2×SDS 上样缓冲液并煮沸然后各取 10 μL 样品以及蛋白质标准物(Cell Signaling Tecnology，MA，USA)点样Tris-SDS 聚丙烯酰胺凝胺垂直电泳 3～5 h，转膜8～12 h；封闭，洗膜，然后以稀释后的兔抗大鼠 ANP(1∶200，Millipore Corporation)室温反应 2 h，再和二抗(1∶1 500)各反应 l h， Supel Signal West Pico 试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc，USA)中反应 5 min显影条带经 1 200Pro 型图像扫描仪扫描，CAMIAS008 图像分析系统处理，根据积分吸光度值对比分析条带的强弱1.8 统计学处理所有数据均以均数±标准差(±s) 表示，采用单因素方差分析及 LSD 法进行统5计学处理P0.05 认为有显著性差异，P0.01 认为有非常显著性差异2 结果2.1 在 UCN 存在下，不同处理因素对心肌细胞体积的影响细胞体积是通过测量细胞直径获得的。

表 1 结果显示，与对照组相比，UCN（0.1 μM）组心肌细胞直径增加, H89（PKA 抑制剂，0.1 μM）组和 Ast（CRH 受体拮抗剂，1 μM）组细胞体积均未见明显改变，表明 H-89 和 Ast 对正常心肌细胞无影响而与 UCN 组相比，UCN+H-89 组、UCN+Ast 组心肌细胞体积均减小，表明 H-89 和 Ast 均能抑制 UCN 诱导的心肌细胞体积的增大 表１ 不同影响因素对大鼠心肌细胞体积的影响（略）*P0.0l,与对照组相比较；#P0.01,与 UCN 组相比较2.2 在 UCN 存在下，不同处理因素对心肌细胞蛋白质合成的影响表 2 结果显示，与对照组相比，UCN（0.1 μM）组心肌细胞蛋白合成增加,H89（PKA 抑制剂，10 μM）组和 Ast（CRH 受体拮抗剂，0.1 μM）组均未见明显改变，表明 H89 和 Ast 对正常心肌细胞蛋白合成无影响而与 UCN 组相比，UCN+H-89组、UCN+Ast 组心肌细胞蛋白合成均降低，表明 H-89 和 Ast 均能抑制 UCN 诱导的心肌细胞蛋白含量的增加表２ 不同影响因素对大鼠心肌细胞［3H］leucine 掺入量的影响（略）*P0.01,与对照组相比较；#P0.01,与 UCN 组相比较62.3 不同处理因素对 UCN 作用的心肌细胞 ANP 表达含量的影响与对照组相比，UCN（0.1 μM）组心肌细胞 ANP 表达明显增加；与对照组相比，H89 组和 Ast 组表达均未见改变，表明 H-89 和 Ast 并不影响正常心肌细胞 ANP表达；与 UCN 组相比，UCN+H-89 组、UCN+Ast 组 ANP 表达降低，表明 H-89 和Ast 均能抑制 UCN 诱导的心肌细胞 ANP 表达含量的增加。

图 3 不同影响因素对大鼠心肌细胞 ANP 表达含量的影响（略）*P0.01,与对照组相比较；#P0.01,与 UCN 组相比较 3 讨论心肌肥厚作用是心脏的一种很重要的调整机制，是心脏负荷过重时一种代偿表现，是心肌细胞对高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞等常见临床疾病的一种基本应答疾病的初始阶段，心肌肥厚可以。