生物转化小组技术报告.ppt

生物转化小组技术报告生物转化小组技术报告主要内容主要内容 一、薄层层析法（一、薄层层析法（TLC））二、硅胶柱层析分离二、硅胶柱层析分离一、薄层层析法（一、薄层层析法（TLC））固固-液吸附色谱液吸附色谱优点：设备简单优点：设备简单，分析速度快，分析速度快；； 高分辨能力，结果直观高分辨能力，结果直观根据薄层层析硅胶型号分为：根据薄层层析硅胶型号分为： 硅胶硅胶 H、硅胶、硅胶 G、硅胶、硅胶 HF254和和硅胶硅胶 GF254，， 要求粒径为要求粒径为 5～～40µm氧化铝）氧化铝）用于小量样品用于小量样品（（几到几十微克，甚至几到几十微克，甚至0.01µg））的分离的分离 TLC正相，极性大的物质先分离出来，极性小的后分离出来正相，极性大的物质先分离出来，极性小的后分离出来d1d2d12薄层色谱示意图1：： 比移值比移值Rf 小，极性强小，极性强2：比移值：比移值Rf 大，极性弱或非极性大，极性弱或非极性（（1））薄层板的制备薄层板的制备n玻璃板：平整、光滑、洗净后不附水珠玻璃板：平整、光滑、洗净后不附水珠。

n调浆：一般调浆：一般30g硅胶加入硅胶加入100gCMC-Na水溶液（水溶液（0.3%～～0.5％）％）顺时针研磨，至无气泡顺时针研磨，至无气泡 硅胶比例大，硅胶比例大，CMC-Na水溶液有沉淀，板易裂水溶液有沉淀，板易裂n涂布：薄层要尽可能均匀光滑，厚度固定（根据实验需要来确涂布：薄层要尽可能均匀光滑，厚度固定（根据实验需要来确定）定）, 0.25 1mmn存放：存放： 室温晾干！硅胶板室温晾干！硅胶板110℃活化活化30min，，氧化铝板在氧化铝板在200 220℃烘烘4h ，放于干燥器中放于干燥器中（（2）点样）点样n样样品品的的溶溶剂剂：：甲甲醇醇、、乙乙醇醇、、氯氯仿仿、、乙乙酸酸乙乙酯酯含含水水量量越越小小越越好n点点样样：：点点样样斑斑点点越越小小越越好好，，直直径径一一般般以以2 4mm为为宜宜，，可可重重复复点样点样要轻，不可刺破薄层点样要轻，不可刺破薄层n点点样样量量：：样样品品太太少少，，斑斑点点不不清清楚楚，，难难以以观观察察；；样样品品量量太太多多，，往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。

n电吹风吹干或干燥器内晾干电吹风吹干或干燥器内晾干（（3）展开剂的选择及配制）展开剂的选择及配制n展开剂的选择：展开剂的选择：Rf值在值在0.15~0.85之间n常用溶剂及相对极性：常用溶剂及相对极性：甲醇＞乙醇＞异丙醇＞乙氰＞氯仿＞乙酸乙酯＞二氯甲烷＞乙醚＞正己烷、石油醚甲醇＞乙醇＞异丙醇＞乙氰＞氯仿＞乙酸乙酯＞二氯甲烷＞乙醚＞正己烷、石油醚 强极性溶剂强极性溶剂 ∣ ∣←――――――中等极性溶剂中等极性溶剂―――――→∣ ∣非极性溶剂非极性溶剂 强极性：三氯甲烷强极性：三氯甲烷/甲醇甲醇 弱极性：丙酮弱极性：丙酮/石油醚石油醚n混合溶剂极性高混合溶剂极性高/ /低低=1/3=1/3（（V/VV/V））nPetroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, MeOH/ethyl acetate, CHCl3/ethyl acetaten展开剂的配制：展开剂的配制： 新鲜配制，新鲜配制，把各组成溶剂移入分液漏斗把各组成溶剂移入分液漏斗，使，使混合液充分混匀混合液充分混匀。

n展开剂的饱和：展开剂的饱和： 双槽的展开缸双槽的展开缸 缸内蒸气饱和时间在缸内蒸气饱和时间在30min左右，防止边缘效应左右，防止边缘效应 切勿使样点侵入展开剂中放板时动作要快切勿使样点侵入展开剂中放板时动作要快 展开剂前沿上升到样点上方展开剂前沿上升到样点上方8 10cm时取出薄层板时取出薄层板（（4）温湿度的控制）温湿度的控制通常温度越低分离越好通常温度越低分离越好，用空调或冰柜控制；，用空调或冰柜控制；湿度影响板的吸附能力，在另一展开槽放置相应浓度的硫酸湿度影响板的吸附能力，在另一展开槽放置相应浓度的硫酸5）显色（显色剂：）显色（显色剂：通用、专属通用、专属））n喷雾显色：喷雾显色：雾化器雾化器，均匀细雾状，均匀细雾状n浸渍显色：专用玻璃器皿或玻璃缸浸渍显色：专用玻璃器皿或玻璃缸n蒸气熏蒸显色：双槽玻璃缸（碘蒸气显色）蒸气熏蒸显色：双槽玻璃缸（碘蒸气显色）（（6）检视装置）检视装置 三用紫外仪三用紫外仪253.7nm下观察下观察薄层色谱定性定量方法薄层色谱定性定量方法n定性方法定性方法1.利用利用Rf定性定性：用标准品对照：用标准品对照2.板上化学反应定性板上化学反应定性：根据所用的显色剂及颜色：根据所用的显色剂及颜色n定量方法定量方法1.直接定量法直接定量法：比较样品和标准品斑点的面积大小颜色及颜色：比较样品和标准品斑点的面积大小颜色及颜色深浅。

目视或用薄层扫描仪目视或用薄层扫描仪2.间接定量法间接定量法：抠下斑点，洗脱，用分光光度计比色洗脱液：抠下斑点，洗脱，用分光光度计比色洗脱液二、硅胶柱层析分离二、硅胶柱层析分离n原理：物质在硅胶上的吸附力不同，原理：物质在硅胶上的吸附力不同， 极性大的易被吸附，吸附解吸附极性大的易被吸附，吸附解吸附n硅胶硅胶H的处理：的处理： 活化：活化：110 ℃烘箱干燥烘箱干燥 l h 脱气：加入干硅胶体积一倍的脱气：加入干硅胶体积一倍的溶剂溶剂 注：硅胶柱不能遇水，吸引水分子形成水膜，注：硅胶柱不能遇水，吸引水分子形成水膜， 影响分离效能影响分离效能硅胶柱分离时洗脱剂选择：硅胶柱分离时洗脱剂选择：n根据文献报道，尝试比例调整根据文献报道，尝试比例调整n据据TLC展开剂比例再稀释一倍！展开剂比例再稀释一倍！氯仿：甲醇氯仿：甲醇=9:1（（18:1））n被分离物质为被分离物质为弱弱极性物质，一般选用极性物质，一般选用弱弱极性溶剂为洗脱剂极性溶剂为洗脱剂，， 被分离物质为被分离物质为强强极性成分，则须选用极性成分，则须选用强强极性溶剂为洗脱剂。

极性溶剂为洗脱剂n极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；n加一点点三乙胺，氨水等碱性物质来中和硅胶的酸性加一点点三乙胺，氨水等碱性物质来中和硅胶的酸性n拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 装柱（最大影响因素！）装柱（最大影响因素！）n湿法装柱湿法装柱和干法装柱和干法装柱，，上表面一定要平整，上表面一定要平整，n一次性倾入一次性倾入要求填充均匀，无断层、无缝隙、无气泡要求填充均匀，无断层、无缝隙、无气泡n硅胶的高度一般为硅胶的高度一般为15cm左右左右（长、粗）（长、粗）,据情况而定据情况而定 柱子径高比一般在柱子径高比一般在 1：：5～～10n平衡柱子（平衡柱子（3-4个柱体积的洗脱剂）个柱体积的洗脱剂）上样上样n柱内的溶剂液面降至吸附剂表层柱内的溶剂液面降至吸附剂表层时开始上样时开始上样n干法上样：样品溶解性差干法上样：样品溶解性差 样品样品+ +少量洗脱剂少量洗脱剂+ +少量硅胶少量硅胶 拌匀后烘干拌匀后烘干 优点：样品层较平整。

优点：样品层较平整n湿法上样：用湿法上样：用少量少量展开剂将样品溶解，沿柱内壁均匀加入展开剂将样品溶解，沿柱内壁均匀加入n加完样后在样品层上再加入一层硅胶，防止冲散样品层加完样后在样品层上再加入一层硅胶，防止冲散样品层洗脱并收集（洗脱并收集（TLC跟踪）跟踪）n梯度洗脱：极性缓慢增大梯度洗脱：极性缓慢增大n样品收集：样品收集： 如果如果被分离各组分有颜色，根据色层收集洗脱液被分离各组分有颜色，根据色层收集洗脱液 如果各组分无色，先等分收集如果各组分无色，先等分收集(自动收集器自动收集器)，然后用，然后用TLC逐一鉴定，再将相同组分的收集液合并在一起逐一鉴定，再将相同组分的收集液合并在一起，浓度 收集的例子：收集的例子：10mg上样量，上样量，1g硅胶硅胶H，，0.5ml收一馏分；收一馏分；1-2g上样量，上样量，50g硅胶（硅胶（200-300目），目），20-50ml收一馏分收一馏分 硅胶柱层析分离过程中，对洗脱液进行硅胶柱层析分离过程中，对洗脱液进行TLC检测，如下：检测，如下：最后的处理：最后的处理： n送谱分析前，用少量的溶剂洗涤一下，去除杂质。

送谱分析前，用少量的溶剂洗涤一下，去除杂质n必要时进行重结晶必要时进行重结晶n如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，可除去氢谱如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，可除去氢谱 1.5ppm左右所谓的左右所谓的“硅胶硅胶”峰 Thank you for your attention!请各位老师和同学提出宝贵的意见和建议请各位老师和同学提出宝贵的意见和建议。