珠江水系特有卷口鱼遗传变异的线粒体Cytb基因序列分析.docx

    珠江水系特有卷口鱼遗传变异的线粒体Cytb基因序列分析    摘 要：测定了广西合山、柳州、桂平和广东郁南等4个地理群体43尾卷口鱼线粒体Cytb基因1 041 bp，结果检测到8个单倍型，7个多态位点4个地理群体的单倍型多样性为0.248~0.700，核苷酸多样性为0.00022~0.00070，表明所分析的卷口鱼群体单倍型多样性和核苷酸多样性低在分子系统树上，不同地理来源的卷口鱼混杂分布在一起，没有形成明显的谱系结构和地理聚群；4个群体两两间的Fst值为-0.028~0.116，但均不显著(P>0.08)；AMOVA分析表明1.70%(P=0.21)的分子差异来自群体间，而98.3%的分子差异位于群体内部；表明4个地理群体间没有显著遗传分化单倍型网络图呈星状结构，中性检测Tajima’s D和Fu’s FS均为显著负值，核苷酸不对称分布分析呈单峰模式，表明珠江卷口鱼可能曾经历过种群的快速扩张，推测在晚更新世(1.5~3.9万年前)出现种群扩张Keys：卷口鱼； 细胞色素b基因； 遗传变异； 珠江水系Q173 ：A ：1004-874X（2010）04-0161-04卷口鱼（Ptychidio jordani Myers）俗称嘉鱼，隶属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)野鲮亚科(Labeoninae)卷口鱼属(Ptychidio)，是珠江水系特有鱼类，与斑鳠、鲈鱼、鳜鱼并称为“珠江四大淡水名鱼”，具有重要的科学研究价值和良好的开发利用前景。

近年来，随着江河污染和过度捕捞的日益加剧，卷口鱼自然资源急剧衰退，种质资源保护和人工养殖越来越受到人们的重视目前对卷口鱼的报道多集中在形态分 析[1-2]、年龄与生长[3-4]、生理生态[5-6]、人工繁殖[7]等方面遗传多样性是物种繁衍、抵抗疾病和适应环境变化的物质基础；遗传结构和种群历史动态反应了物种遗传变异的时空分布格局和进化历史[8]杜合军[9]和Zhu等[10]分别利用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)和微卫星(Microsatellite)分析了3个卷口鱼地理群体核基因组的遗传多样性和遗传分化，但没有种群历史动态分析；卷口鱼线粒体DNA的遗传分析尚未见报道线粒体DNA为母系遗传，不发生重组，进化速度较双亲遗传的核基因组快，而有效种群数量仅为核基因组的1/4，是核基因组分子标记的重要补充，特别适合研究动物种群的遗传变异[11]粒体基因组中，线粒体细胞色素b基因(Cytochrome b，Cytb)是种内与种间遗传变异研究中应用最为广泛的分子标记[12]为此，本研究开展了珠江水系卷口鱼4个地理群体Cytb基因的遗传变异分析，以期揭示卷口鱼线粒体基因的遗传多样性和遗传结构以及种群历史动态，为卷口鱼种质资源保育和开发利用提供更为全面的遗传资料。

1 材料与方法 1.1 试验材料试验用鱼为2005年7月至2009年10月间从珠江沿江本地作业的小型渔船上采集的野生卷口鱼，其中广西柳州（柳江）9尾、合山（红水河）14尾、桂平（浔江）5尾及广东郁南（西江）15尾，共43尾，用95%的酒精保存备用1.2 试验方法测序了43尾卷口鱼的细胞色素b基因全序列，DNA提取、PCR和序列测定参照陈艺燕等[13]1.3 数据处理测定的序列经人工校对后用ClustalX 1.83进行序列比对[14]；MEGA4.0计算核苷酸组成和变异、转换和颠换值，采用Kimura2-parameter（K2-p）模型构建单倍型邻接树，以1 000次bootstrap计算支持率[15]用DNASP5.10.00统计群体单倍型多样度(haplotype diversity，h)、核苷酸多样度(nucleotide diversity，π)[16]利用Arlequin 3.11软件计算两两间Fst值，进行分层AMOVA分析，采用1 000次置换分析其统计学显著性[17]以TCS1.21软件建立网状亲缘关系[18]以Arlequin 3.11软件计算Tajima’s D和Fu’s FS值，进行核苷酸不对称分布分析，获得τ值[18]；用公式τ=2ut估算种群扩张时间[19]，其中τ是扩张时间参数；u=2μk，μ为cytb基因的变异速率，采用（1%~2.5%）/百万年[20]，k表示序列长度；t表示自扩张以来所经历的代数；扩张时间T=t×代时。

2 结果与分析2.1 卷口鱼Cytb基因的序列特征及遗传变异在长度为1 041 bp的Cytb基因序列片段中，T、C、A、G平均含量分别为28.5%、27.7%、29.8%和14.0%；在密码子3个位点中，第1位4种碱基频率相近；第2位中T最高（41.6%）、G最低（13.2%）；第3位中A最高（43.7%），而G只占4.0%；碱基组成表现出明显的反G偏倚，与多种硬骨鱼类相似[21]在43条序列中共发现8个单倍型，7多态位点，其中2个简约信息位点，所有变异均为转换，无颠换，符合同种鱼类中线粒体基因转换远高于颠换的特征[21]所编码蛋白质的氨基酸序列中，只发现2个变异位点（191位丙氨酸A突变为苏氨酸T，214位天冬氨酸D变为天冬酰胺N）各群体及总体遗传多样性参数见表1，桂平群体的单倍型多样度(h=0.700)及核苷酸多样度(π=0.00070)均最高，郁南群体h=0.248及π=0.00022均最低与相同水系宽鳍鱲(h=0.823，π=0.0027)和马口鱼(h=0.953，π=0.0333）[22]、中间黄颡鱼(h=0.556，π=0.00383)[23]、黑脊倒刺鲃(h=0.863，π=0.00188)[24]相比，卷口鱼总体的遗传多样性指数(h=0.411，π=0.00040)均为最低，表明卷口鱼遗传多样性并不高。

2.2 卷口鱼遗传结构及种群历史动态在4个地理群体43尾卷口鱼中，共发现8个单倍型，其中单倍型H2为33个体所共享（柳州6、合山11、桂平3、郁南13），H1为合山1个体与柳州1个体共享，H3为郁南2个体和合山1个体共享，其他单倍型为各群体所特有（图1）在基于K2-p模型构建的邻接树（图1）中，不同地理来源的单倍型散乱无序地分布于各分枝中，没有形成明显地理聚群和谱系结构柳州、合山、桂平、郁南两两群体间Fst值分别为 -0.021（P=0.77）、0.009（P=0.64）、0.0045（P=0.14）、0.0047（P=0.42）、-0.028（P=0.69）、0.116（P=0.08），表明卷口鱼4个群体间没有显著遗传分化[25]AMOVA分析表明1.70%（P=0.21）分子差异来自群体间，98.30%的分子差异位于群体内部两两群体间Fst值及分层AMOVA分析说明4个地理群体间无明显遗传分化单倍型关系网络图（图2）呈星状(star-like)结构，其中1个主体单倍型（H2）位于网络图的中心，各群体单倍型均匀分布，没有表现出明显的地理结构，提示研究区域内的卷口鱼曾发生过种群扩张将所有个体作为一个整体，进行Tajima’s D和Fu’s FS中性检验得D=-1.958（P=0.006），FS=-7.073（P=0.000），结果均显著偏离中性；核苷酸不配对分布(图3)呈单峰类型，表明卷口鱼经历过快速扩张[19]。

根据τ的观测值0.537，以代时为3[3-4]，估算出卷口鱼种群扩张时间约为3.9~1.5万年前，即更新世的晚期 3 结论与讨论杜合军等[9]利用RAPD技术检测了广西桂平、广东郁南和肇庆等地30尾卷口鱼的遗传多样性，Zhu等[10]利用微卫星技术分析了广西柳州、桂平和广东郁南等地115尾卷口鱼的遗传多样性和遗传分化，均认为西江卷口鱼的遗传多样性较高但在本研究中，广西合山、柳州、桂平和郁南4个地理群体43尾卷口鱼的线粒体Cytb基因1 041 bp的序列中，仅检测到8个单倍型和7个多态位点，单倍型多样性和核苷酸多样性都很低导致RAPD和SSR分析与线粒体分析结果并不一致的原因如下：（1)杜合军等和Zhu等所分析的卷口鱼中可能至少存在2个种群，其较高的遗传多样性来源于不同种群混杂的结果[9-10]；而本研究所分析的种群则仅为1个种群；（2）RAPD和SSR检测的是双亲遗传的核基因组多个基因位点的遗传变异情况，较单一位点的线粒体基因组信息量大；线粒体基因组是严格母系遗传，无有重组，变异来源限于基因突变，而Cytb基因作为蛋白质编码基因，受到选择压力较大，进化速率受到限制Zhu等[10]对3个卷口鱼地理群体的微卫星分析和本研究对4个地理群体线粒体Cytb分析均表明所研究的地理群体间没有显著地理分化，一方面可能与卷口鱼起源较晚或者经历过瓶颈效应有关。

卷口鱼分布区仅限于珠江水系[26]，推测其起源可能在华南水系与海南水系分离之后本研究估计出卷口鱼可能在3.9~1.5万年前经历过瓶颈效应后的扩张，而Cytb基因的变异速率约（1%~2.5%）/百万年[17]，在较短时间内还不足以积累较高的变异，产生明显分化另一方面，则可能是Zhu等[10]和本研究所涉及的珠江中下水游4个地理群体间没有明显地理障碍，群体间基因交流频繁，导致遗传分化不明显传统形态学数据和框架数据分析表明，珠江水系柳江段至西江段之间可能至少存在4个形态上具有明显差异的群体[1-2]，杜合军等[9]的RAPD分析亦表明可能至少存在2个不同的地理群体，表明西江鱼类可能具有较为复杂的遗传结构核基因组和线粒体基因组遗传分析分别从双亲遗传和母系遗传的角度反映物种的遗传变异和种群进化历史，二者结果的不一致表明仅采用单一类型的遗传标记分析可能会得出错误的结果虽然本研究利用线粒体Cytb基因作为分子标记分析了西江水系中下游的4个卷口鱼地理群体遗传多样性、遗传结构及种群历史动态，发现较低的遗传多样性和单一的群体遗传结构；但受采样范围和样品数量少的限制，不排除在未采样范围中存在具有显著遗传分化的其它群体的存在。

鉴于单一类型分子标记的片面性、Cytb基因的保守性以及已有遗传分析地理群体有限，有必要在将来的研究中同时采用进化速率更快的线粒体控制区和其核基因分子标记（如SSR、AFLP等）对整个珠江水系的卷口鱼遗传背景进行深入研究Reference：[1] 刘毅辉，焦宗立，陈永乐，等. 珠江卷口鱼形态特征与染色体组型[J].水产学报，2007，31(6)：721-725.[2] 赵建，朱新平，陈永乐，等. 珠江卷口鱼不同地理种群的形态变异[J].动物学报，2007，53(5)：921-927.[3] 崔淼，赵俊，陈湘粦.卷口鱼的年龄和生长[J].华南师范大学学报(自然科学版)，2001(4)：9-15.[4] 廖国璋，尤炳赞，白岳强，等.珠江卷口鱼年龄生长、食性和繁殖的研究[J].水产学报，2001，10(1)：71-86.[5] 谢刚，许淑英，祁宝伦，等.卷口鱼耗氧规律的研究[J].大连水产学院学报，2002，17(2)：89-94.[6] 谢刚，祁宝伦，许淑英，等.卷口鱼的临界水温和溶氧量[J].淡水渔业，2001，31(2)：47-48.[7] 祁宝伦，谢刚，叶星，等.野生卷口鱼的人工驯养初步试验[J].水利渔业，2001，21(3)：26.[8] Utter F M.Biochemical genetics and fishery management： an historical perspective [J].J Fish Bio，1991，39： 1-20.[9] 杜合军，朱新平，陈昆慈，等.珠江野生卷口鱼遗传多样性的RAPD分析[J].水产学报，2006，30(3)：305-310.[10] Zhu X P，Zhao J，Chen K C，et al. Genetic analysis of r。