极端嗜热古菌—硫化叶菌拓扑异构酶的研究.pdf

摘要硫化叶菌( S u l f o l o b u s ) 是一种极端嗜热古菌，其最适生长温度为8 0 C ，最适生长p H 为3 左右，基因组D N A 被认为呈松弛状态或略带正超螺旋本文通过QS e p h a r o s e 、H e p a r i n 柱层析，结合S D S ．P A G E 纯化、变性、复性等步骤，从芝田硫化叶菌( S J ^ f 6 4 缸P ) 中分离纯化了一种反旋转酶S D S —P A G E 显示，纯化的反旋转酶分子量为1 2 6 k D a ，在M 9 2 + 或c a 2 + 存在的情况下．可利用A T P 水解的能量在低盐浓度下( 1 0 m MN a C I ) 向D N A 分予中引入正超螺旋N 一末端序列及同源性搜索发现，该酶的编码基因为t o p R l ，而非先前从该菌中克隆得到的t o p R 基因拓扑异构酶I 是在细菌、古菌和真核生物中普遍存在的一种拓扑异构酶已完成全序列测定的硫磺矿硫化叶菌( ss o l f a t a r i c u s ) 编码一个推测的拓扑异构酶I ( S s oT o p oI ) 本文克隆并在大肠杆菌中表达了编码S s oT o p oI 的基因，采用一个包括热处理的简单纯化程序纯化了重组蛋白。

活性分析表明，重组蛋白能够松弛负超螺旋D N A ，因此是拓扑异构酶I 定点突变实验证实318 位的酪氨酸是该酶的活性位点，突变酶( Y 3 1 8 F ) 完全丧失了负超螺旋松弛活性和寡核苷酸切割能力S s oT o p oI 不能松弛正超螺旋D N A ，其负超螺旋D N A 松弛活性不依赖A T P 的存在，但依赖于二价阳离子( M 9 2 + 或C a 2 + ) 该酶的最适p H 为7 ．5 —9 ．0 ，最适反应温度为7 5 ℃，该酶具有较高的热稳定性，8 5 C 保温3 小时后，酶活只是略有降低该酶的作用模式受盐浓度的影响，在低盐浓度下( 5 0 r a M )为行进式，而在高盐浓度下( 2 0 0 n [ I M ) 为分布式在标准的实验条件下，该酶表现出很高的负超螺旋松弛活性，4 0 f m o l 的酶在3 0 分钟内就可以完全松弛3 0 0 n g负超螺旋p U C l 8 质粒对大肠杆菌T o p oI 有抑制作用的化学物质一亚精胺，可明显促进该酶的活性S s oT o p oI 具有对含有特异切割序列的单链寡核苷酸的切割活性，该酶的特异性切割序列为G ( A ／T ) C A ( T ) A G ( T ) G ( A ) Xlx x 。

切割模板的长度对该酶的切割活性有很大影响，切割模板在切割位点的5 ’端至少要有8 个碱基，3 ’端至少要有2 个碱基S s D T o p oI 的切割活性依赖于二价阳离子的存在，在试过的阳离子中，M g ”，C a ' + ，C u ”，C o ”，M n 2 + 和N i2 + 等均可支持切割，该酶的切割活性受温度影响，当温度低于3 7 “ C 时，活性明显减弱本文首次对古菌的拓扑异构酶I 进行了较为详细的研究aA b s t r a c tS u l f o l o b u ss h i b a t a e ，ah y p e r t h e r m o p h i ca r c h a e o n ，l i v e so p t i m a l l ya t8 0 “ C ．T h eg e n o m i cD N Ai sb e l i e v e dt ob er e l a x e do rs l i 曲t l yp o s i t i v e l ys u p e r c o i l e d ．Am a j o rr e v e r s eg y r a s ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yf r o mS u l f o l o b u ss h i b a t a eb yu s i n gan o v e lp u r i f i c a t i o np r o t o c o li n v o l v i n gc h r o m a t o g r a p h yo nQS e p h a r o s ea n dh e p a r i nS e p h a r o s ec o l u n m sa n de l e c t r o p h o r e s i si nS D S - p o l y a c r y l a r n i d eg e l ．T h ea c t i v i t yo ft h eg e l —p u r i f i e de n z y m ew a sr e c o v e r e db yd e n a t u r a t i o na n dr e n a t u r a t i o n ．T h ep r o t o c o la l l o w e de f f e c t i v ea n dr e p r o d u c i b l es e p a r a t i o no fl ℃v e r s eg y r a s ef r o mt h er e s to ft h ec e l l u l a rp r o t e i n s ．T h ep u r i f i e dr e v e r s eg y r a s ei sa p p r o x i m a t e l y12 6k D ai nm o l e c u l a rm a s s ，a n di t sa b i l i t yt oi n t r o d u c ep o s i t i v es u p e r c o i l si n t ot o p o l o g i c a l l yc o n s t r a i n e dD N Ad e p e n d so nt h ep r e s e n c eo f A T P , l o ws a l tc o n c e n t r a t i o na n dam e t a lc o f a c t o r ( M 9 2 + o rc a 2 + 1 ．N ．t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i ss h o w st h a tt h ep r o t e i ni se n c o d e db yat o p R - 1h o m o l o g u ea n dn o tt h et o p Rg e n ep r e v i o u s l yc l o n e df r o mSs h i b a t a e ．T o p o i s o m e r a s eIi sw i d e l yp r e s e n ti nb a c t e r i a ，a r c h a e aa n de u k a r y a ．Ap u t a t i v et o p oI Ae n c o d i n gg e n ew a si d e n t i f i e di nt h eg e n o m eo fSs o l f a t a r i c u s ，w h i c hh a sb e e ns e q u e n c e dr e c e n t l y ．T h eg e n eW a so v e r e x p r e s s e di nE ．c o l ia n dp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yu s i n gas i m p l ep r o c e d u r ei n c l u d i n gah e a tt r e a t m e n ts t e p ．M u t a g e n e s i se x p e r i m e n t ss u g g e s tt h a tt h et y r o s i n er e s i d u ea tp o s i t i o n318W a st h ea c t i v es i t eo f t h ee n z y m e ．T h er e c o m b i n a n tp r o t e i ni sh i 曲l ye f f i c i e n ti nr e l a x i n gs u p e r c o i l e dD N Ai nt h ep r e s e n c eo fam e t a lc o f a c t o r ( M ，+ o rc a 2 + ) ．T h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ei s3i n d e p e n d e n to f t h ep r e s e n c eo f A T ET h ea c t i v i t yo f t h ee n z y m ei sm o s ta c t i v eo v e rap Hr a n g ef r o m7 , 5t o9 ．0 ．T h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rt h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ei s7 5 ‘C ．S s oT o p oIi sr e l a t i v e l yt h e r m o s t a b l e ，i n c u b a t i o na t8 5 “ Cf o r3h o u r s ，t h ep r o t e i nr e t a i n sm u c ho fi t so r i g i n a la c t i v i t y ．T h ee n z y m er e l a x e st h et e m p l a t ei nap r o c e s s i v em o d ei nl o ws a l ta n dad i s t r i b u t i v em o d ei nh i 曲s a l t ．S p e r m i d i n e ，a nE ．c o ，fT o p oIi n h i b i t o r , s t i m u l a t et h ea c t i v i t yo f S s oT o p oIa tl o wc o n c e n t r a t i o n ．S s oT o p oIh a so l i g o n u c l e o t i d ec l e a v a g ea c t i v i t yi nt h ep r e s e n c eo f ．am e t a lc o f a c t o r ( M g ”，C a z + ，c u 2 + ，c d + ，M n 2 + o rN i 2 + ) ．T h ec l e a v a g ea c t i v i t yd e p e n d so nt h el e n g t ho fo l i g o n u c l e o t i d ea n ds e q u e n c e ，T h em i n i m a ls u b s t r a t er e q u i r e m e n tf o rc l e a v a g eh a sb e e nd e t e r m i n e dt oc o n s i s to f8b a s e s5 ’t ot h ec l e a v a g es i t ea n d2b a s e s3 ‘t Ot h ec l e a v a g es i t e ．T h。