泛素结合结构域在泛素化底物鉴定中的应用.doc

泛素结合结构域在泛素化底物鉴定中的应用 王京伟 武军驻 武汉大学人民医院检验科 武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系 摘 要： 泛素化 (Ubiquitylation) 是目前真核细胞内已知的最复杂的翻译后修饰泛素化底物的识别需要一类特异性受体蛋白介导, 这些受体蛋白往往包含一个或多个泛素结合结构域 (UBDs) UBD-泛素间的特异性结合决定了泛素化底物功能的特异性目前已发现 20 多种 UBDs 超家族可识别泛素化底物上的特异性功能团进而传递信号因此深入了解 UBD 的识别机制对新 UBD 的发现及泛素化底物的鉴定具有重要意义关键词： 泛素; 泛素结合结构域; 泛素化蛋白质组学; 作者简介：王京伟 (1986-) , 女, 汉族, 博士, 主治医师, 主要从事分子诊断与个体化医疗研究及蛋白质组学研究基金：武汉大学青年教师自主科研项目 (2042015kf0113) Application of Ubiquitin Binding Domains in the Identification of Ubiquitination TargetWANG Jing-wei WU Jun-zhu Department of Clinic Laboratory, Renmin Hospital of Wuhan University; Department of Biochemistry, School of Medicine, Wuhan University; Abstract： Ubiquitylation is the most complex post-translational modification in eukaryotes.The cellular processes modulated by ubiquitylation are deciphered by a specific ubiquitylated target by a'downstream'ubiquitin receptor, which is also known as a ubiquitin-binding protein (UBP) , containing a class of specific ubiquitin binding domains (UBD) .The fate or function of ubiquitylated target was determined by this specific UBD-ubiquitin interactions.Over twenty distinct ubiquitin-binding domain (UBD) families specifically recognize the motif one the ubiquitylated target surfaces.Therefore, it is of great significance to deeply understand the regulatory mechanisms of UBDubiquitin interactions for found out the new UBD and the deep mining of ubiquitinated proteome (ubiquitome) .Keyword： Ubiquitin; Ubiquitin binding domain; Ubiquitome; 泛素化 (Ubiquitylation) 是泛素分子以泛素单体或泛素链的形式共价修饰细胞内其它翻译后的蛋白质。

泛素化修饰可利用泛素本身所包含的 7 个赖氨酸位点 (K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63) 和位于 N 端的甲硫氨酸 (Met1) 位点, 发生自泛素化进而延伸成不同类型的多聚泛素链, 如最常见的 K48 和 K63位多聚泛素链已有学者先后利用高精度质谱技术在酿酒酵母体内检测到 8 种同质性的多聚泛素链类型[1,2], 并发现不同类型泛素链的丰度存在较大差异此外, 单泛素化、多位点单泛素化、杂合异质型泛素链、分枝状多聚泛素链以及游离多聚泛素链等多种泛素化修饰形式陆续被发现, 多元化的泛素化修饰方式从侧面反映了真核细胞中蛋白质泛素化修饰的普遍性、结构的多样性、调控的复杂性及功能的重要性不同蛋白质底物、同一底物的不同氨基酸修饰位点及同一位点上的不同泛素链类型均可导致细胞效应的差异泛素化修饰可改变靶蛋白的亚细胞定位、影响其蛋白活性, 进而调控细胞内蛋白酶体降解途径、囊泡运输、信号转导、DNA修复、转录调节、细胞周期调控、抗原提呈、凋亡、自噬以及细胞分化等生物学过程蛋白质的泛素化修饰可影响甚至决定底物蛋白的命运, 泛素化及其信号转导的改变或失衡可引发包括癌症、神经退行性疾病在内的多种严重且难以治愈的人类疾病。

因此深入研究泛素及其修饰系统, 鉴定泛素化底物蛋白, 了解其调控机制对相关疾病分子机制的理解和治疗具有重要意义1 泛素结合结构域 (Ubiquitin Binding Domains, UBDs) 1.1 UBDs 概述UBDs 与泛素、类泛素蛋白质 (包括它们的结合、去结合状态) 、底物蛋白、泛素化酶以及蛋白酶体所构成的系统总称为泛素化网络泛素化网络的调节取决于一类可以特异性识别不同长度及不同修饰类型泛素链或泛素单体的受体蛋白家族, 即泛素结合蛋白 (Ubiquitin Binding Proteins, UBPs) , 每个 UBP 往往包含一个或多个 UBDs[3,4]UBD 可识别并结合不同类型的泛素化修饰并传递信号, 进而决定底物蛋白功能的特异性因此 UBDs 在泛素化信号网络中有着举足轻重的作用UBDs 分子量较小, 多在 20-150 个氨基酸之间, 可独立折叠形成稳定结构以非共价键的形式直接结合单泛素化或聚泛素化底物1.2 UBDs 的分类目前已发现的 UBDs 有 20 多种, 根据其空间构象特点将其分为 5 种类型1.2.1 α 螺旋结构 (α-Helix) 结构域:α-Helix 结构域包含已知的 UIMs、UBAs、泛素相互作用基序相反的结构域 (Motif Interacting with Ubiquitin or Inverted UIM, MIU/IMIU) 、UMI 和MIU 相关泛素结合结构域 (UIM-and MIU-related UBD, UMI) 、双面 UIM (Double-sided UIM, DUIM) 、泛素结合基序 (Ubiquitin-binding Motif, UBM) 、UBAN、CUE 结构域、定位于高尔基体的含 γ 衔接蛋白耳的 ADP 核糖基化因子结合蛋白和 Myb 的靶标 TOM 上的结构域[GGA (Golgi-localized, Gamma-ear-containing, ADP-ribosylation-factor-binding Protein) and TOM (target of Myb) , GAT]、液泡分选蛋白 Vps27、HRS、STAM 上的结构域[Vacuolar Sorting Protein) 27/Hrs/STAM, VHS]、UIM 类似结构域等;其中最普遍的是UIM 和 UBA 结构域。

UIM 结构域是第一个被发现的 UBDs, 是一段大约 20 个氨基酸残基的肽段, 存在于蛋白酶体亚基 S5a/RPN10 蛋白中根据 S5a 内 UBDs 的氨基酸序列, 采用隐马尔可夫模型以及迭代数据库搜索的方法在其它蛋白中找到了类似的序列, 将其统称为 UIM 结构域核磁共振光谱 (NMR) 技术显示 UIM 结构域的空间构象是一段短的螺旋, 该构象可以很好的将所有的保守残基暴露于表面UBA 结构域是第一个通过生物信息学技术发现并广泛存在于泛素修饰相关酶内UBDs几乎与 UIMs 同时期被发现UBA 结构域是一段由约 45 个保守氨基酸残基组成的短肽, 可以识别单泛素化或聚泛素链修饰的底物蛋白, 液态结构解析发现某些 UBP 保守疏水区域内存在两个 UBA, 两个 UBA 与其 linker 区域一起形成 3 个串联的螺旋束结构, 大大增强 UBA 结构域与底物的结合能力根据识别泛素链的类型以及能力可以将 UBA 家族分为四类:第一类:选择性识别 K48 位多聚泛素链的 UBA 家族, 如 hR23A-UBA2;第二类:偏好于 K63-Ub4 的 UBA 家族, 如泛素结合酶 E2-25K-UBA 及蛋白 Drm2 上的两个 UBAs;第三类:不识别任何类型泛素链的 UBA 家族 (占已发现的 UBA 家族的 30%) , 如 isoT-UBA1 和 c-Cbl-UBA;第四类:与多种泛素链类型有等效结合力的 UBA 家族, 如 isoT-UBA2, Cbl-b-UBA 和 UQ1-UBA。

近来研究还发现, UBA 和 UIM 可保护泛素化底物蛋白不被降解[5], 然而这种保护的机制以及发挥保护作用的生物空间还不甚明了1.2.2 锌指结构 (Zinc Finger, ZnF) :ZnF 包含泛素结合锌指 (Ubiquitin-binding Zinc Finger, UBZ) 、Npl4 锌指 (Npl4Zinc Finger, NZF) 、泛素特异性加工蛋白酶锌指 (Ubiquitin-specific processing Protease ZnF, ZnF UBP) 、A20 锌指 (A20ZnF) 、多聚泛素相关锌指结构域 (Polyubiquitin-associated Zinc Binding, PAZ) 等根据其泛素分子表面的识别热点可将其分为 2 类一类 ZnF 以螺旋结构识别泛素 β 折叠上 Ile44 疏水补丁, 空间排列上与泛素分子的 β 折叠呈平行或反平行[6]另一类 ZnF 家族成员识别泛素分子 C 末端的氨基酸残基, 其广泛存在于异肽酶 T (Isopeptidase, IsoT) 中ISoT 的这一独特性识别位点使其能特异性地识别并催化泛素化底物释放游离泛素链, 并可与其它识别 Ile44 疏水中心的 UBDs 成员一起协同识别并作用于泛素化底物。

1.2.3 泛素结合酶类似结构域 (Ubiquitin-conju-gating, Ubc-like Domain) :Ubc-like Domain 包括泛素结合酶 (Ubiquitin-conjugating Enzyme, Ubc) 、泛素结合酶 E2 变体 (Ubiquitin-conjugating Enzyme E2Variant, UEV) 结构域等;Ubc-like Domain 往往以 β 折叠的构象存在, 参与单泛素化蛋白的识别部分 Ubc-like Domain 只有识别泛素链中泛素单体间的 linker 区域, 充分暴露水解位点才能完成对泛素链的水解, 该类结构域主要存在于去泛素化酶 (Deubiquitinating Enzymes, DUB) 内不同 DUBs 家族内 UBDs 对不同泛素链类型有很高的特异性[7,8]还有一部分 Ubc-like domain 可同时识别底物蛋白及其修饰的泛素 (链) , 虽然这两种结合方式都比较弱, 但两者协同作用不但增加了结合能力也提高了结合的特异性[9]1.2.4 普列克底物蛋白同源结构域 (Pleckstrin Homology Domain, PH Domain) :PH Domain 包括 GRAM 样泛素蛋白结合结构域 (GRAM-like Ubiquitin-binding in Eap45, GLUE) 、普列克底物蛋白同源结构域 (Plekstrin Homology for Ubiquitin, PRU) 等;内体蛋白分。