橄榄油乳化法测定脂肪酶活性的优化研究.pdf

《食品工业》2011年第6期80工艺技术浙江海洋学院食品与药学学院（舟山 316004）橄榄油乳化法测定脂肪酶活性的优化研究滕宏飞，王丹静，徐青，辛建美，罗红宇*橄榄油乳化法是测定脂肪酶活性的常用方法，其测定的原理是天然油脂被水解产生的游离脂肪酸可以被氢氧化钠中和，根据消耗氢氧化钠的量间接测定脂肪酶的活力中国药典 2005年版提供了一种测定胰脂肪酶水解活力的方法[1]，但操作比较复杂，且需要一台精密的 pH计指示滴定终点国内外研究者通常采用的方法是以酚酞指示终点[2]后一种方法的测定体系中含有缓冲液，有学者对该法的合理性产生怀疑[3]此外，乳化液的颜色会影响滴定终点的判断，使得该法的重复性不好我们以猪胰脂肪酶为研究对象，对该法的反应体系和反应条件进行探索，试图找出影响该法准确性的关键因素并加以优化，从而建立一套准确性高、重现性好的脂肪酶活的测定方法1 材料与方法1.1 材料、试剂与仪器脂肪酶(猪胰)：国药集团化学试剂有限公司；橄榄油为化学纯：国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯醇( PVA)， KH2PO4， Na2HPO4•2H2O， NaOH，邻苯二甲酸氢钾，酚酞指示剂， 95%中性酒精均为国产分析纯。

CU420型电热恒温水箱：上海益恒实验仪器有限公司； JZ-Ⅱ型均质器：铁道部电化院四方电器设备厂； SHY-3水浴恒温振荡器：江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂1.2 试验方法1.2.1 传统橄榄油乳化法测脂肪酶活性[2]取两只 150 mL三角瓶，依次标记为空白瓶( A)和样品瓶( B)，分别加入 PVA橄榄油乳化液 4 mL和0.025 mol/L pH7.5磷酸缓冲液 5 mL(应将附着在瓶壁上的乳化液冲下)，再于 A瓶中加入 95%乙醇 15 mL，置 40 ℃水浴加热 5 min，然后在两瓶中各加入酶液1 mL，立即计时，反应 15 min后，在 B瓶中立即加入95%乙醇 15 mL中止反应，加酚酞指示剂 2滴，用 0.05 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至微红色为终点酶活计算公式如下：酶活力( U)= （ 1）式中， M为 1 mL 氢氧化钠标准液所含的微克分子数； n为稀释倍数1.2.2 橄榄油浓度对酶活测定的影响其他条件如 1.2.1，考察橄榄油浓度分别为 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%的 PVA橄榄油乳化液对酶活测定的影响。

摘 要 以猪胰脂肪酶为例，针对传统橄榄油乳化法存在准确度较低、重现性不佳等问题，对底物浓度及用量、均质时间、缓冲液添加量、反应体系温度、反应环境等反应条件进行了优化研究：以20%橄榄油乳化液 5 mL代替 25%橄榄油乳化液 4 mL，以 3 mL磷酸盐缓冲液代替 5 mL磷酸盐缓冲液，将均质处理的速度与时间由高速( >10 000 r/min)、 6 min降低为 5 000 r/min、 2 min，将反应体系温度由 40 ℃降低为 35 ℃，改变静止的反应环境为在 100 r/min下振荡反应，选择在空白组反应体系中加入 1 mL0.025 mol/L pH7.5磷酸缓冲液代替 1 mL酶液优化后的条件下测得的脂肪酶活力较优化前提高了 35%以上，平行测定的 RSD值为 5.5%，方法的精密度较高关键词 橄榄油；乳化法；脂肪酶；优化Optimization Study of Olive oil Emulsifi cation Method Determining Lipase ActivityTeng Hong-fei,Wang Dan-jing, Xu Qing, Xin Jian-mei, Luo Hong-yu*Academy Of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University (Zhoushan 316004)Abstract Taking porcine pancreas lipase for example, as the traditional olive oil emulsifi cation methods is with problems of low accuracy and poor reproducibility, the reaction conditions including the substrate concentration and amount, the homogenization time, the amount of buffer liquid added, reaction temperature and reaction environment were optimized. The 4 mL, 25% olive oil emulsion instead of 5 mL, 20% olive oil emulsion was used and the 3 mL phosphate buffer instead of 5 mL phosphate buffer was used. Meanwhile, the homogenization speed and time from high-speed (> 10 000 r/min), 6 min reduced to 5 000 r/min, 2 min; the reaction temperature decreased from 40 ℃ to 35 ℃ ; the static reaction environment was changed to 100 r/min oscillation; 1 mL, 0.025mol/L phosphate buffe at pH7.5 was added in the control group instead of 1 mL enzyme solution. Under optimum conditions, lipase activity is increased by 35% than the activity of before optimization and parallel determination of the RSD is 5.5%. The method is of high precision.Keywords olive oil; emulsifi cation method; lipase; Optimization2010年浙江海洋学院大学生科技创新项目。

氢氧化钠消耗量（ m/h）反映时间（ min）× M× n81《食品工业》2011年第6期工艺技术增加，橄榄油浓度超过 25%时，底物过量，脂肪酶被完全饱和，酶促反应速率与底物浓度无关，此时可测得最大酶活可见，当乳化液用量相同时， 25%的橄榄油浓度是准确测定酶活力的最适浓度考虑到 20%橄榄油乳化液在稳定性上要优于 25%的橄榄油乳化液，我们通过增加 20%橄榄油乳化液用量来实现底物浓度的饱和，进一步比较这两种乳化液对脂肪酶活力测定的结果，如表 1所示5mL 20%乳化液与 4 mL 25%乳化液所含橄榄油的量相当，但酶活力较后者提高了 6.7%这可能是因为25%乳化液的粘稠度较大，不利于脂肪酶与底物的接触；而 20%乳化液粘稠度较低，脂肪酶可以较好地与底物接触，有利于催化反应的进行因此， 可以考虑选用 20%的橄榄油乳化液 5 mL作为反应底物2.2 乳化液的均质时间对测定结果的影响橄榄油乳化液一般是通过高速搅拌均质的方式制备，通常做法是高速( >10 000 r/min)处理 6 min控制均质器的转速在 13 000 r/min，比较了不同搅拌时间对酶活测定的影响，如图 2所示。

随着搅拌时间的延长，脂肪酶的酶活力呈现逐渐下降的趋势，具体原因尚待进一步探究根据上述结果，固定处理时间为 2 min，分别以 5 000， 7 000， 9 000，11 000， 13 000 r/min的搅拌速度制备乳化液，结果如下图 3所示如图 3所示，脂肪酶的酶活力随着搅拌速度的提高也呈现出下降的趋势可见，乳化液的制备时间不宜太长，转速也不宜太快，初步确定以 5 000 r/min处理 2 min的乳化液进行后续研究2.3 缓冲液添加量对测定结果的影响由于脂肪酶对环境 pH的变化比较敏感，缓冲液的1.2.3 乳化液均质处理的时间与搅拌速度对酶活测定的影响其他条件如 1.2.1，以 13 000 r/min的速度分别搅拌2， 4， 6， 8， 10， 12 min，考察不同均质时间的乳化液对酶活力测定的影响根据最佳搅拌时间，分别以5 000， 7 000， 9 000， 11 000， 13 000 r/min制备乳化液，考察不同搅拌速度对酶活测定的影响1.2.4 缓冲液添加量对酶活测定的影响其他条件如 1.2.1，分别向反应体系中加入 0 mL，1 mL， 3 mL， 5 mL， 7 mL， 9 mL的缓冲液，考察缓冲液添加量对酶活力测定的影响。

1.2.5 反应体系温度对测定结果的影响其他条件如 1.2.1，调节水浴温度分别为 25 ℃， 30 ℃，35 ℃， 40 ℃， 45 ℃， 50 ℃，考察反应温度对酶活力测定的影响1.2.6 不同反应环境对测定结果的影响其他条件如 1.2.1，考察振荡反应与静置反应对酶活测定结果的影响1.2.7 对照组的处理方式对测定结果的影响其他条件如 1.2.1，考察对照组中以缓冲液代替酶液对酶活测定结果的影响1.2.8 优化前后酶活力测定结果的比较根据上述试验结果，在优化后的最佳反应条件下，测定脂肪酶活力大小，并与传统脂肪酶活力测定方法进行比较2 结果与分析2.1 橄榄油浓度对测定结果的影响通常采用的橄榄油乳化液中橄榄油的浓度为25%(橄榄油与乳化剂按1 ︰ 3的比例混合)，用量为4 mL由于橄榄油与乳化剂的比例对乳化液的稳定性有一定的影响，在保证测定结果准确度的前提下，选择橄榄油浓度尽可能低的乳化液以延长其保存时间，从而简化反复制备乳化液这一步骤是有益的为此，我们以 PVA为乳化剂，分别配制了橄榄油浓度( V/V)为 5%， 10%， 15%， 20%， 25%， 30%， 35%的乳化液用于酶活的测定，结果如图 1所示。

如图 1所示，橄榄油浓度在 5%~25%时，猪胰脂肪酶的酶活力随着橄榄油浓度的增加而增加，并在橄榄油浓度为 25%时，达到最大值，继续增加橄榄油浓度，酶活力不再增加这是因为酶促催化反应存在酶饱和现象[3]，当橄榄油浓度较低时，脂肪酶没有完全被橄榄油所饱和，因而酶活力随着底物浓度的增加而表1 不同浓度和用量的乳化液测得的脂肪酶活力的比较图2 不同搅拌时间对酶活测定的影响图1 不同浓度橄榄油的乳化液对酶活测定的影响橄榄油浓度 /% 用量 /mL 酶活力 /(U·g-1)20255 13334 1250图3 不同搅拌速度对酶活测定的影响《食品工业》2011年第6期82工艺技术力不再增加由此可见，采取 100 r/min的振荡环境对提高脂肪酶催化能力是很有必要的2.6 空白组的处理方式对测定结果的影响通常采用的橄榄油乳化法中对空白组的处理是先向三角瓶中加入 15 mL95%乙醇，再加入酶液，但反应体系中乳化剂的存在可能导致乙醇不能使脂肪酶立刻失活，在保温过程中，少量脂肪酶仍可能保持微弱的活性为此，我们以 1 mL0.025 mol/L pH7.5磷酸缓冲液代替 1 mL酶液(酶液以 0.025 mol/L pH7.5磷酸缓冲液配制)，同时与传统方法进行比较，结果如下表 3所示。

从表 3中可以看出，采用在空白组。