HPLC法测定注射用头孢噻肟钠的有关物质【药学论文】.doc

药学论文-HPLC 法测定注射用头孢噻肟钠的有关物质【摘要】 改进 HPLC 测定注射用头孢噻肟钠中有关物质的方法在美国药典和欧洲药典(英国药典)方法的基础上，优化了两种不同流动相系统，用梯度洗脱对注射用头孢噻肟钠的有关物质进行了分离结果样品中各成分的分离度及检出灵敏度完全满足有关物质限度的测定要求改进后的 RPHPLC 方法能更加真实有效的反映注射用头孢噻肟钠的有关物质含量，可有效控制产品的质量 【关键词】 头孢噻肟钠； 有关物质； 高效液相色谱法ABSTRACT To improve the method for determination of related substances of cefotaxime sodium for injection. On the basis of USP and EP (BP) methods, different mobile phase systems were optimized. Gradient elution was applied on the separation of cefotaxime sodium and its related substances. The resolution and sensitivity of related substances were acceptable. The detection limit was 100ng. This method was found to be simple and selective. It could be used to control the quality of product effectively.KEY WORDS Cefotaxime sodium; Related substances; HPLC注射用头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)为第三代头孢菌素，抗菌谱广，抗菌活性强，临床应用广泛［1，2］。

《中国药典》1995 年版采用微生物检定法测定头孢噻肟钠的含量，2000 年版修订为 HPLC 法，但直到 2005 年版仍未对有关物质进行要求美国、欧洲和英国［3～5］等各国药典对注射用头孢噻肟钠有关物质的测定方法均有收载，且在欧洲药典中已确证头孢噻肟钠中可能存在4 个杂质，国内尚未见有报道为完善我国药典收载的质量标准，本文借鉴美国药典、欧洲药典和英国药典的方法，建立切实可行的控制头孢噻肟钠有关物质的方法1 仪器与试药1.1 仪器岛津 10A 高效液相色谱仪(LC10ATvp 高压泵，SIL10ADvp 进样器，SPDM10A PDA 检测器，DGU14A 脱气机)；MilliQ 纯水机(Millipore公司)1.2 药品与试药 注射用头孢噻肟钠(批号 0406132)由哈药集团三精制药有限公司提供；注射用头孢噻肟钠(批号 050103)由浙江亚太药业股份有限公司提供；注射用头孢噻肟钠(批号 050321025)由苏州东瑞制药有限公司提供甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为 Hypersil Gold(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长 235nm；流速1.0ml/min；进样体积 10μl。

流动相 I(梯度洗脱) 流动相 A 为 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液∶甲醇(86∶14)；流动相 B 为 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液∶甲醇(60∶40)0.05mol/L 磷酸盐缓冲液的配制 取 7.1g 磷酸氢二钠至 1000ml 量瓶中，加水溶解至接近刻度，用磷酸调节溶液 pH 至 6.25，加水定容至 1000ml)，梯度洗脱程序见表 1流动相 II(等度洗脱) 流动相为磷酸盐缓冲盐∶甲醇(85∶15)磷酸盐缓冲液的配制 3.5g 磷酸二氢钾和 11.6g 磷酸氢二钠至 1000ml 量瓶中，加水溶解至接近刻度，调 pH 至 7.0，加水定容至 1000ml2.2 样品溶液的配制取头孢噻肟钠 40mg 至 50ml 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀2.3 流动相 I 与流动相 II 的比较(1)分离效果的比较 流动相 I 流动相 I 系统为美国药典分析头孢噻肟钠采用的系统完全按照流动相 I 的梯度洗脱程序，发现主峰与前后相邻的杂质不能很好的分离针对分离情况，将梯度洗脱程序进行相应调整后，调整后的洗脱程序如表 2 所示结果分离效果较好，主要分离出样品中含有的 12 个杂质(图 1)。

流动相 II 为欧洲药典(英国药典)在分析头孢噻肟钠采用的系统完全按照流动相 II 的等度洗脱程序，发现主峰前分离出的杂质个数与流动相 I 的相同，但是主峰后的杂质在 1h 之内没有出峰为了缩短分析时间，将主成分出峰后改为梯度洗脱，样品色谱图显示 45min 之内可以将主峰后的杂质完全洗脱，洗脱程序如表 3 所示，但是色谱基线漂移比较严重(图 2)2)最低检出限的比较 两种流动相在同一根色谱柱上得出的头孢噻肟钠的最低检出限(以 S/N=3 表 1 流动相 I 梯度洗脱程序 计)基本一致，为100ng2.4 两种流动相比较结果小结通过对流动相 I 和流动相 II 在同一根色谱柱上分离效果及最低检出限的比较，发现对流动相比例作适当调整后，流动相 I 和流动相 II 均能检出相同数量的杂质，分离效果均较好，但是流动相 II 为等度洗脱，主成分后杂质的酯溶性较强，若维持原流动相中有机比例不变，主成分后杂质在 1h 内不能出峰，将主成分出峰后改为梯度洗脱，增加流动相中有机溶剂的比例，可将主峰后杂质洗脱，但是相对于流动相 I，调整后流动相 II 的基线漂移幅度较大，且梯度洗脱的流动相为纯水相和纯有机相，而流动相 I 中两相流动相 A 和流动相 B 均为加有不同有机溶剂比例的混合相，有利于色谱条件的稳定，同时两种方法的最低检出限基本一致，所以最终采用流动相 I 的洗脱方法进行粗放性考察。

2.5 系统适应性实验溶液的选择美国药典中系统适应性实验溶液配制 取 1ml 对照品溶液加 7ml 水和 2ml甲醇，加 25mg 碳酸钠固体混合溶解，室温放置 10min，加 3 滴冰乙酸，1ml 对照品溶液，混合均匀 欧洲药典(英国药典)中系统适应性实验的溶液配制 取 4.0ml 样品溶液加入 1.0ml 稀盐酸溶液，40℃加热 2h，加 5.0ml pH6.6 的缓冲溶液，1.0ml 稀氢氧化钠溶液美国药典中的系统适应性溶液是头孢噻肟钠的碱破坏溶液，而欧洲药典(英国药典)中的系统适应性溶液是头孢噻肟钠的酸破坏溶液从色谱图可以看出，美国药典中的系统适应性实验主要产生一个杂质(杂质 1)，产生的杂质数目较少，而欧洲药典(英国药典)中的系统适应性溶液，产生的杂质较多，不仅产生杂质 1，而且还产生明显的杂质 2、杂质 3 和杂质 4从样品的色谱图可以看出，杂质 1 在多数样品中是最大杂质，而且样品中也存在与杂质 1 相邻的杂质 2，与主峰相邻的杂质 4 在样品中也存在，两对杂质的分离效果是确定色谱条件的关键，因此杂质 1 和杂质 2 的分离度以及杂质 4 和主峰的分离效果可以充分体现色谱系统的分离效果。

所以，采用欧洲药典(英国药典)中的系统适应性溶液更能保证色谱条件的分离效果(图 3)2.6 方法的粗放性考察采用另外两根 B 型色谱柱和一根 A 型色谱柱对方法进行粗放性考察结果显示两种类型色谱柱的分离效果均较好，但是 B 型色谱柱的色谱峰对称性较好(拖尾因子小于 1.2)，不拖尾；而 A 型色谱柱的色谱峰有明显拖尾(拖尾因子大于 1.5)，所以优先选择 B 型色谱柱(图 4)2.7 三批样品的测定结果对三批实际样品， 采用 Hypersil Gold(250mm×图 3 系统适应性溶液及样品溶液的 HPLC 色谱图图 4 系统适应性溶液在不同类型色谱柱上的 HPLC 色谱图 4.6mm，5μm)色谱柱进行有关物质测定，计算方法采用 1%对照品对照法，结果见表 43 讨论3.1 色谱柱的选择性［6］A 型色谱柱 早期色谱柱，无定型或球形硅胶，与 B 型相比，硅胶纯度较低，重金属含量较高，键合密度较低，碳载量较低，未采用封尾技术或不完全封尾技术，硅羟基活性较高，残留硅羟基导致的“第二效应”较强，能与碱性(含 N 原子)化合物、酸性化合物发生氢键和离子交换作用，造成色谱峰拖尾，但对于某些极性化合物，硅羟基是组分分离的主要因素。

B 型色谱柱 球型高纯硅胶，重金属含量相对较低，键合密度较高，碳载量较高，采用非极性基团封尾技术(短碳链烷基)或其它技术，使硅羟基活性较低，能改善碱性(含 N 原子)化合物、酸性化合物的分离试验结果也充分证明 B 型色谱柱色谱峰的拖尾因子要明显小于 A 型色谱柱的色谱峰3.2 系统适应性实验及梯度洗脱比例的调整采用欧洲药典(英国药典)的系统适应性溶液，在调整后的 USP 色谱系统的HPLC 色谱图中杂质 1 和杂质 2 的分离度以及杂质 4 和主峰的分离情况可以充分体现出色谱系统的分离效果采用不同色谱柱进行方法粗放性试验，发现有些色谱柱需要对梯度洗脱的表 4 三批注射用头孢噻肟钠样品的有关物质测定结果 程序表进行一些必要的调整才能达到比较好的分离效果在对色谱条件的梯度洗脱程序进行调整时，需要确保杂质 1 和杂质 2 的分离度在 1.0 以上，杂质4 和主成分的分离度在 1.5 以上，以保证色谱的分离能力；此外，根据文献［7］，应在头孢噻肟主峰出峰结束时再改换梯度洗脱3.3 有关物质的限度美国药典、欧洲药典(英国药典)对注射用头孢噻肟钠有关物质含量的计算方法均是采用 1%对照品对照法，但是限度的规定却不是一致的。

美国药典规定单个杂质不得超过 6.0%，总杂质不得过 10.0%；欧洲药典(英国药典)规定单个杂质不得过 1.0%，总杂质不得过 4.0%三批样品均符合规定，提示有关物质的限度以欧洲药典(英国药典)为准更为妥当4 结论通过对美国药典、欧洲药典(英国药典)中头孢噻肟钠有关物质测定方法的比较，得出美国药典中色谱方法的分离效果和色谱稳定性等方面均优于欧洲药典(英国药典)的方法对美国药典方法的粗放性考察，结果显示应优先选择 B型色谱柱色谱系统的适应性溶液采用欧洲药典(英国药典)方法中的酸破坏溶液，以保证色谱条件的分离效果有关物质的限度，从本文三批样品的测定结果来看，采用欧洲药典(英国药典)中规定的限度更适合参考文献】［1］ 霍天凤，周栋梁. HPLC 测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠的含量及有关物质［J］. 华西药学杂志，2005，20(3)：249～251.［2］ 陈吉生. 反相高效液相色谱法测定头孢噻肟钠的含量［J］. 中国医院药学杂志，2000，20(6)：341～342.［3］ The United States Pharmacopoeial Convention Inc. The United States Pharmacopoeia XXIX ［S］. Rochville MD: the United States Pharmacopoeial Convention Inc., 2006:422.［4］ European Directorate for the Quality of Medicine. The European Pharmacopoeia 5.0 ［S］. Strasbourg, France: the Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe, 2005:1214～1215.［5］ The British Pharmacopoeia Commission. The Briti。