双链rna引发了基因沉默.pdf

双链RNA引发了基因沉默 — — — 评2006年诺贝尔生理学或医学奖金由辛研究员,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室主任,上海200031关键词 双链RNA 基因沉默 RNA干扰2006年诺贝尔生理或医学奖授予美国斯坦福大学医学院的安德鲁 · 菲尔(Andrew Fire)和麻省理工大学医学院的克雷格 · 梅洛(Craig Mello) ,以表彰他们发现了双链RNA引发的基因沉默他们的发现为基因治疗提供了新技术 — — —siRNA ,为后基因组时代基因功能研究提供了新手段,这一发现也导致天然小分子调控RNA和RNA调控系统的发现,引发人们对生命本质的重新思考2006年10月2日,诺贝尔医学奖评选委员会宣布, 本年度的诺贝尔生理学或医学奖授予美国斯坦福大学 医学院的安德鲁 · 菲尔(Andrew Fire)和麻省理工大学 医学院的克雷格 · 梅洛(Craig Mello) ,以表彰他们发现 了双链RNA引发的基因沉默此前,很多人都相信RNA干扰(RNAi ,亦即由双链RNA引发的基因沉默) 一定会获得诺贝尔奖但悬念有两个:一是何时获得诺 贝尔奖,二是谁能获得诺贝尔奖。

关于第一个悬念,在20世纪50年代以前,一个重大发现,几年后(不足10 年)即可获得诺贝尔奖如Ochoa S于1955年发现多 核糖核酸磷酸化酶可以核苷二磷酸(NDP)为底物合成 多核苷酸(即长链RNA)4年后,即1959 ,他与Kon2berg(发现DNA聚合酶催化DNA的生物合成)共同获 得诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔奖授予Ochoa ,是因 为相信他发现了RNA生物合成的途径但很快就发 现,多核糖核酸磷酸化酶实际是催化RNA降解的酶,产 物为NDPOchoa发现的是该酶在特定条件下的逆反 应同样Konberg发现的DNA聚合酶,是参与DNA 的修复,而不是真正参与DNA复制的酶因此,以后诺 贝尔奖的授予与科学发现时间的间隔变得较长,通常在10年以上,这样使一个科学新发现能够接受较长时间的 检验菲尔和梅洛从发现双链核糖核酸引发基因沉默 到获奖只有8年,是几十年间授奖速度较快的一个诺贝 尔奖这主要是RNAi作为一种基因沉默技术,已经被 成功地广泛使用关于第二个悬念,在菲尔和梅洛得到 获奖通知时也还是感到有点突然1 RNA干扰的发现20世纪70年代末,在原核生物中发现一类小分子RNA(长度为100～300个核苷酸)。

如大肠杆菌细胞膜上有孔,膜孔由OMPF(由ompf基因编码)和OMPC(由ompc基因编码)两种蛋白质组成在任何情况下,组成膜孔的这两种蛋白质的总量是恒定的;但在不同生理条件下,它们的比例是不同的原来ompc基因的表达受到生理状态的调控,而该基因转录出作为OMPC蛋白模板的mRNA时,也转录出一个长度为174个核苷酸的RNA这种小分子RNA可以与ompf mRNA的部分序列反向互补配对,因为占位而抑制了ompf mRNA的翻译,因此转录ompc mRNA越多, ompf mRNA翻译越少通过这种方式保持了两种蛋白总量的恒定,而两种蛋白的比例可随生理条件的变化而变化这种小分子RNA与靶mRNA (通常被称为正义链)反向互补,因此被称为反义RNA这是第一次发现RNA具有调控功能此后,虽然很多实验表明,在真核生物中也可能存在反义RNA ,但一直未能在真核生物中找到天然的反义RNA而依据反义RNA的原理,如果人为将反义RNA或反义寡脱氧核苷酸(反义ODN)导入真核细胞,常常可以成功抑制靶mRNA的翻译此后,反义RNA和反义ODN这两种技术被广泛应用于生物和医药研究中如1986年,在烟草植株中高表达反义nos RNA ,引发了nos基因沉默,因为它由反义RNA引发,所以被称为反义沉默。

沉默的意思就是使基因不被表达20世纪90年代初,科学家在矮牵牛花中导入与花青素合成有关的查尔酮合成酶基因原以为转基因的牵牛花会变得更鲜艳结果却发现,一些花反而被漂白了这种过度表达内源基因而引发的基因沉默被称为·123·自 然 杂 志 28卷6期诺贝尔奖简介共阻遏在上述的研究背景下,幸运的菲尔和梅洛摘得了那只已经熟透了的最大的 “桃子” 他们在进行线虫基因沉默的研究中,分别注射肌肉蛋白的正义RNA、 反义RNA和双链RNA结果无论是注射正义RNA ,还是反义RNA ,均未发现子代线虫有任何表型的变化但被注射双链RNA的子代线虫则发生了罕见的抽搐运动,这表明肌肉蛋白的翻译受到了抑制,发生了基因沉默,并且这种影响可以遗传给子代(图1)他们将这种双链RNA抑制基因表达的现象称为RNA干扰( RNAi) ,把引发RNA干扰现象的RNA称为干扰RNA研究论文发表在1998年的Nature周刊上[1 ]图1 实验示意图:给线虫分别注射正义、 反义和双链RNA ,前两种注射物对子代线虫的行为无影响,而注射双链RNA的线虫,其子代发生了罕见的抽搐运动此后, RNA干扰现象被证明广泛存在于真菌、 线虫、 果蝇、 植物、 动物等多种生物中。

在上述的烟草反义沉默中,外源导入基因表达的反义RNA和内源的正义RNA可形成双链RNA在共阻遏中,过度表达的正义RNA的高级结构内存在双链RNA区,因此它们引发的基因沉默同样是由双链RNA造成的2001年,发现长度在30个核苷酸以下的短双链小分子干扰RNA (siR2NA) ,比以前使用的长双链RNA干扰技术有更高的专一性,更小的副反应[2 ]从此,siRNA技术得到了广泛应用,RNAi技术也得到突飞猛进的发展2 RNA干扰的生理意义RNA干扰发现以前,在植物病毒研究中就已发现,植物感染RNA病毒后会发生称为恢复的现象,即感染初期,植株带有大量病毒,植株局部有严重的感染症状,但随后植物组织内病毒数量开始下降,这种植株对诱导病毒和其他相关病毒会产生抗性这种现象实际上就是病毒诱导的基因沉默,即在外来病毒诱导下产生的使病毒基因沉默的现象在RNA干扰现象发现后的研究表明,病毒诱导的基因沉默现象是由病毒RNA在滚环复制过程中产生的双链RNA所引发的这也使人们认识到,RNA干扰现象对于真核高等生物而言,是一种生物防御机制对于DNA病毒,生物也可通过下述的DNA甲基化修饰途径,抑制病毒DNA基因的开放。

人有约200种不同的细胞,所有细胞均有相同的基因组各种细胞是如何开放各自特有的约5 000个基因,而特异地关闭其他的约2万个基因呢?原来在受精卵发育分化的过程中,不断有新的不同序列的siRNA(约26个核苷酸长度)出现,并启动染色体不同部位DNA的甲基化反应siRNA通过碱基配对原理,指导DNA甲基化酶,结合到DNA的特异部位,引发该部位DNA中胞嘧啶的甲基化,这个过程称为从无到有的DNA甲基化合成这种已被甲基化的DNA在复制过程中可以指导DNA新生链中GC位点胞嘧啶的甲基化,这称为甲基化的维持DNA甲基化进而可引发染色质蛋白的甲基化、 乙酰化等,造成该区段染色质的异染色质化,异染色质区段的基因被沉默由于这种沉默依赖于siRNA的转录,因此被称为转录基因沉默( TGS) ,这种方式在植物和动物中都可发生上述过程是表观遗传学研究的内容高等真核生物染色体中都含有相当数量的转座子等可移动元件,它们可诱发突变而危害生命上述的DNA甲基化过程使转座子及移动元件区异染色质化,从而稳定了基因组分析数据表明,细胞内大量转座子都处于异染色质区遗传信息传到mRNA后,生物还可通过一些其他途径控制mRNA上遗传信息的阅读方式。

其中的一种方式就是由siRNA (约21个核苷酸)引发的转录后基因沉默(PTGS)细胞质中成熟的双链siRNA与一些蛋白质因子形成相对分子质量约为5 000 000的 “RNA诱导的沉默复合物( RISC)” siRNA双链中的正义链被排除出复合物, RISC中的siRNA反义链指导RISC结合到靶mRNA的相应位点,然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNATGS和PTGS都是生物调控基因表达的方法(图2)3发现RNA干扰的科学意义首先,RNAi技术使分子生物学在方法学上取得了新的突破在后基因组时代,人们需要基因沉默技术使某一特定基因沉默,通过研究该基因沉默后的生理生化·223·Chinese Journal of N ature Vol.28No.6Brief Introduction of Nobel Prize图2 RNA干扰的作用机理,这种机理与原核生物中的反义RNA作用机理不同a.标准的siRNA结构b.任何来源的双链RNA (病毒、 过表达的正义RNA、 外源导入的双链RNA、 天然siRNA的前体等) ,被Dicer类酶降解成siRNA; siRNA与AGO蛋白等组装成RISC;正义链被排出复合物,RISC被活化;反义链指导RISC与靶RNA上的特异配对区结合;在复合物中核糖核酸酶III的作用下,靶RNA被降解变化,来了解该基因的生物学功能。

如果一种基因的表达(如癌基因)可以引起疾病,人们就可以通过基因沉默技术来抑制该基因的表达达到治病的目的(称为基因治疗)RNAi已成为最常用的基因沉默技术,它比以往的其他基因沉默技术,如反义ODN、 核酶等技术,更有效、更灵敏、 更方便,更安全目前能被RNAi技术沉默的基因数以百计,利用RNAi原理研制的药物也已进入临床研究其次,RNA干扰现象的发现导致了天然小分子干扰RNA的发现,并导致一系列小分子调控RNA的发现,如2001年的微小RNA ( miRNA)的发现miRNA是一类单链RNA ,长度与siRNA相仿由此向前追溯,1993年发现的线虫lin24和2000年发现的线虫let27可以被认为是最早发现的miRNA ,它们参与控制线虫的发育时序let27 (22个核苷酸)中一个核苷酸的突变就能使线虫停留在幼虫期,不能成熟,而以前人们认为它们可能是反义RNA几年间发现的大量天然miRNA来源于斑马鱼、 果蝇及其他高等动植物,它们的功能涉及细胞分化、 发育生长、 细胞凋亡、 癌症发生、 生物对称性等多个方面一些报道提出了siRNA和miRNA在进化上的关系RNA病毒的侵染,形成了我们基因组中的转座子(如L1和Alu等)。

转座子可以引起各种DNA的改写事件当一个蛋白基因被反向倍增,就形成了大发夹结构的转录物这种转录物成为siRNA的前体siRNA可以从一个发夹结构前体上得到一系列长度基本固定而序列不均一的双链短RNA序列不均一的siRNA中,很多序列是低效的,它们在靶mRNA上的结合位点,因各种原因(如有蛋白结合、 处于紧密的RNA结构中等)不是最佳的结合位点因为进化的压力,从siR2NA前体的茎环结构中,逐渐进化出miRNA ,miRNA同样来自发夹结构的前体两者的区别在于, miRNA只从短发夹前体上成熟出固定的一种短单链RNA植物中miRNA的积累,需要DCL1、HEN1、H YL1和AGO1蛋白,但不需要DCL3和RDR2蛋白后两种蛋白是siRNA积累时需要的有些单链小分子RNA原来被认为是miRNA ,而实际上它们的积累却需要包括DCL3和RDR2在内的上述全部6种蛋白因此它们不同于一般的miRNA ,它们是一类新的小分子调控RNA ,被称为是反式siRNAmiRNA与siRNA间的分界变得逐渐模糊2006年又发现了piwiRNA (26～31个核苷酸) ,其功能还不清楚,推测可能与精子发生有关。

它们并不是由Dicer(加工siRNA和miRNA的酶系)加工生成的,而是通过Piwi蛋白发挥作用,特异性地在种系细胞中表达估计长度在20～30核苷酸间其他调控小RNA还将被陆续发现4科学在思想碰撞中前进[3]1893年Kossel A认识到染色质是由核酸和组蛋白组成的根据生理学的研究,他认为核质与新组织的形成有关他与其学生们,发现了除鸟嘌呤以外的四种常见碱基和核糖由于他在蛋白质(组。