ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化.doc

1ES 细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮 肤类似物的分化作者：刘爱军， 黄锦桃， 李海标【摘要】 【目的】以 ES 细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物，探讨其在皮下的分化潜能 【方法】 Hoechst33342 标记 E14-ES 细胞，经羊膜诱导 4 d 后，形成表皮干细胞克隆，并以其作为种子细胞，取 129 胎鼠成纤维细胞与复合凝胶－明胶海绵复合，形成皮肤类似物，埋植于 129 小鼠皮下组织术后 2 周、4 周、6周、8 周取材，做 HE 染色观察，β1 整合素、CK15、CK19、CEA、CK18 免疫组化荧光双标和免疫组化观察 【结果】 术后 2 周和 4 周，植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构， 6 周和 8 周后，可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构，免疫双标结果显示，植入 2 周和 4 周，带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈 β1 整合素、CK15、CK19、CEA 和 CK18 阳性，6 周和 8 周后，HE 染色中汗腺样结构呈 CEA、CK18 阳性 【结论】ES 细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物，在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。

【关键词】 ES 细胞； 表皮干细胞； 皮肤附属结构； 定向分化； 羊膜Abstract： 【Objective】 To explore the differentiation potency of skin analog reconstructed with ES cell-derived epidermal stem cells and dermal analog in hypodermis. 【Methods】 E14-ES cells, labeled with Hoechst 33342, were cocultured with human amnion. Four days later, epidermal stem cell clones were formed. The skin analog was reconstructed with ES-derived epidermal stem cells and dermal analog, which reconstructed with 129 mice fetus fibroblasts and compound gel-gelatin sponge. The skin analogs were transplanted into 129 mice hypodermis. The differentiation 2tissues of skin analog were sampled at 2w, 4w, 6w, and 8w. Sections were observed with HE staining, immunohistochemical and di-labeled immunofluorescence methods to test the expression of β1 integrin, CK15, CK19, CEA, and CK18. 【Results】 Sections showed tubular or follicular like structure formed with simple or stratified epithelium at 2 and 4 weeks. Keratinized stratified squamous epithelium, sweat gland- like, sebaceous gland-like and hair follicle-like structures were observed at 6 week and 8 week after transplantation. Cells labeled by Hoechst 33342, formed tubular or follicular-like structure, expressed β1 integrin, CK15, CK19, CEA and CK18 positive respectively at 2w and 4w. The sweat glands-like structure expressed CEA and CK18 positive respectively at 6w and 8w. 【Conclusion】 Skin analogs reconstructed with ES-derived epidermal stem cells and dermal analogs can differentiate into keratinized stratified squamous epithelium, sweat gland-like, sebaceous gland-like and hair follicle-like structures in hypodermis.Key words: ES cells； epidermal stem cells； skin appendages； committed differentiation； amnion目前组织工程皮肤的种子细胞多采用角质形成细胞，它只能形成表皮，不能形成皮肤附属结构。

我们先前的研究表明，胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）细胞经人羊膜诱导后，分化为 ES 细胞源性表皮干细胞，将其植入裸鼠皮下、腹腔及小鼠肾被囊内均具有分化角化复层上皮、毛囊样、皮脂腺样和汗腺样结构的潜能，表明 ES 细胞源性表皮干细胞具有相当稳定的分化潜能［1－4］，因此以 ES 细胞源性表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞具有重要的研究和应用价值在胚胎发育的过程中，真皮对表皮及其附属物的发生、分化具有重要作用，真皮中的细胞主要是成纤维细胞，具有分泌细胞外基质和多种生物活性因子的功能，我们用成纤维细胞和明胶海绵与复合凝胶组成类真皮，观察其在皮下对 ES 细胞源性表皮干细胞分化的影响，为进一步构建具有皮肤附属结构的组织工程皮肤打下基础1 材料和方法1.1 材 料31.1.1 细胞和所用材料 129 小鼠 E14 胚胎干细胞由中山大学附二院黄绍良教授提供人羊膜采自中山大学附一院产房足月妊娠剖腹产的胎膜Hoechst33342（Sigma 公司）；成纤维细胞培养基（100 mL/L 新生牛血清－高糖DMEM）；ES 细胞源性表皮干细胞维持培养基（专利配方）1.1.2 实验动物 孕龄 12.5～14.5 d 昆明小鼠；清洁级 129 小鼠，约 20～25 g，清洁级 SD 大鼠，约 100 g，均雌雄不拘，购自中山大学北校区实验动物中心。

1.1.3 免疫组化试剂 Ⅰ抗：小鼠抗人 β1 整合素单抗（迈新试剂公司），小鼠抗人CK19 单抗、兔抗人癌胚抗原（CEA）多抗、小鼠抗人 CK 18、小鼠抗人 CK15 单抗、Ⅱ抗及 Avidin 结合的 SABC-Cy3 试剂盒均购自博士德试剂公司1.1.4 真皮材料 明胶海绵：由南京金陵制药厂生产，规格：6 cm × 2 cm × 0.5 cm，批号：021211剪成 1 cm × 1 cm × 0.2 cm 大小，孔径大小约为 300～550 μm1.1.5 自制复合凝胶 将鼠尾胶原、甲壳糖、透明质酸、硫酸软骨素（质量比 7 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.5）紫外灯照射下，用 0.05 mol/L 的乙酸搅拌融解 2～3 h，冰浴条件下加入0.5 mL 10×DMEM 培养基， NaOH 调 pH 为 7.3，终体积为 4 mL，4 ℃储存备用鼠尾胶原购自广州红十字会医院，脱已酰甲壳糖、透明质酸、6-硫酸软骨素均为SIGMA 公司产品1.2 方 法人羊膜的制备及 ES 细胞源性表皮干细胞的体外诱导分化见参考文献［5］1.2.1 ES 细胞的核标记 选择生长良好的对数生长期 ES 细胞，将培养液换成标记4培养液（ES 完全培养液加 Hoechst33342 5～10 ng/mL），置体积分数 5％CO2 培养箱中 37 ℃培养箱 1～3 h，吸弃标记培养液，PBS 洗 3 次，换 ES 细胞完全培养液继续培养。

1.2.2 129 胎鼠皮肤成纤维细胞的培养 孕龄 17 d 至出生前的 129 孕小鼠，处死后，无菌条件下取出胚胎，去除胚胎头、四肢和内脏，剪碎躯干部分组织，加入 2.5 g/L胰蛋白酶消化 1 min，用含血清的培养基中止消化，离心，弃上清，用培养基重新悬浮组织，将组织接种入 25 cm2 培养瓶，体积分数 5％CO2 37 ℃静置培养，4～6 d 原代细胞长满，消化传代，3～5 代细胞用于实验1.2.3 皮肤类似物的构建 将诱导后的 ES 细胞源性表皮干细胞和成纤维细胞均按 1×105 个/mL 与复合凝胶混匀，滴加入明胶海绵，每块复合物体积约 1 cm × 1 cm × 0.1 cm1.2.4 皮下移植实验 129 小鼠用 40 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉（按 1 mL/100 g用药），固定于手术台上，剃去背部毛，消毒后，沿背部正中线两侧距脊柱 1 cm 切开皮肤，分离皮下组织，暴露肌层，将构建的皮肤类似物埋入皮下，每只动物埋两块，缝合皮肤，动物苏醒后饲养，共 8 只动物 1.2.5 组织学检查 术后 2、4、6、8周取材，每次取 2 只动物，4 块组织，用 40 g/L 多聚甲醛固定 6～8 h，所得标本一半常规石蜡包埋，连续切片 6 μm，HE 染色；另一半标本 300 g/L 蔗糖过夜，冰冻切片，免疫组化染色，免疫组化染色按 SABC-Cy3 法，行 β1 整合素、CK19、CK15、CEA 和 CK 18 抗体免疫组织化学显色，β1 整合素浓度为 1∶30，余Ⅰ抗浓度均为 1 ∶ 100；Ⅱ抗浓度为 1 ∶ 100， SABC-Cy3 荧光显色。

2 结 果52.1 体外培养细胞的观察Hoechst33342 标记 ES 细胞 1～3 h 后，于荧光倒置显微镜下可见细胞核被标记为蓝色的细胞克隆（图 1），人羊膜上诱导 4～5 d 后，仍可见生长在羊膜表面的细胞克隆呈蓝色核标记培养的胎鼠皮肤成纤维细胞生长旺盛，细胞饱满（图 2）2.2 大体观察术后 2 周时，皮下埋植物体积较植入时无显著变化，呈白色，有结缔组织包绕，4周后增生的组织块体积增大明显，6 周增大达高峰2.3 HE 染色2 周时植入的类真皮材料已降解吸收，2～4 周多见单层立方或柱状上皮围成的管状和泡状结构，少见复层上皮围成的管腔样结构，上皮细胞排列紧密，核染色情况及核与胞浆的比例与正常细胞相似，未见异常增生6～8 周植块中，除上述结构外，还可见复层角化上皮和角化珠、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样（图 3A, B, C, D）等结构，与正常小鼠皮下组织的结构有明显不同（图 4）2．4 免疫组化和免疫荧光双标2 周组织块中，可见单层或复层管状或泡状结构分别呈核荧光（图 5A）和 β1 整合素、CK15、CK19 双标阳性（图 5B），6 周后核荧光衰减， 但 HE 染色中汗腺样结构（图 6A）呈 CEA（图 6B）和 CK18 阳性。

3 讨 论6我们以往的研究［1-5］表明，利用人羊膜与胚胎干细胞共培养，可将其定向诱导为表皮干细胞，表皮干细胞在裸鼠皮下、腹腔及同种 129 小鼠肾被囊内具有相同的分化时程，即在 4 周前主要分化为单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构，4 周后才分化发育为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样和皮脂腺样等结构这些结果强烈提示外环境的改变对 ES 细胞源性表皮干细胞的固有分化发育过程影响不大，ES 细胞源性表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞具有重要的研究应用价值皮肤由表皮和真皮构。