禽流感的采样及实验室诊断L.ppt

禽流感的采样及实验室诊断徐 辉浙江省畜牧管理局重要依据高致病性禽流感 样品采集、保存及运输技术规范（行业标准，NY/T 765—2004 ）高致病性禽流感高致病性禽流感 监测技术规范监测技术规范 （行业标准，NY/T 770—2004 ）高致病性禽流感　免疫技高致病性禽流感　免疫技术规术规范范（行业标准，NY/T 769—2004 ）省防治禽流感工作领导小组办公室省防治禽流感工作领导小组办公室 ：关于规范高致病性禽关于规范高致病性禽流感防治工作流感防治工作有关事项的紧急通知有关事项的紧急通知 （密电2004[10]号）高致病性禽流感 流行病学调查技术规范 （行业标准，NY/T 771—2004 ）禽流感送检样品的采集采样器械的准备动物检疫器械箱，保温箱或保温瓶，解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，碘酒棉，注射器及针头样品容器（如西林瓶，平皿， 1.5mL 塑料离心管， 10mL 玻璃离心管及易封口样品袋，塑料包装袋等）试管架，塑料盒（ 1.5mL 小塑料离心管专用），铝饭盒，瓶塞，无菌棉拭子，胶布，封口膜，封条,冰袋采样刀剪等器具和样品容器须经无菌处理 不干胶标签、签字笔、圆珠笔、记号笔、采样单、记录本等；口罩、一次性手套、乳胶手套、防护服、防护帽、胶靴等。

样品采集基本要求 应从死禽和处于急性发病期的病禽采集样品，样品要具有典型性采样过程要注意无菌操作，同时避免污染环境采样人员要加强个人防护 对病死禽应采集组织样品取死亡不久的 5 只病死禽采样，病死禽数不足5只时，取发病禽补齐 5 只每只禽采集肠及肠内容物 1 份；肺和气管样品 1 份；肝、脾、肾、脑等各 1 份并分别采集上述每个样品取样重量为 15g~20g，放于样品袋或平皿中，如果重量不够可取全部脏器（如脾脏）， 不同禽只脏器不能混样，同一禽只不同脏器不应混样样品采集完后，将样品封口，贴上标签样品采集基本要求 对发病禽拭子样品，应取 5 只病禽采样，每只采集泄殖腔拭子和喉气管拭子各 1 个，将样品端剪下分别置于含有抗生素 PBS或生理盐水 的）小塑料离心管中，封好口，贴好标签泄殖腔拭子采集方法：将棉拭子插入泄殖腔约 1.5~2cm,旋转后沾上粪便 喉气管拭子采集方法：将棉拭子插入口腔至咽的后部直达喉气管，轻轻擦拭并慢慢旋转，沾上气管分泌物保存喉气管拭子的 PBS 或生理盐水中抗生素浓度 小珍禽采泄殖腔拭子容易造成伤害，可只采集 5 个新鲜粪便样品（每个样品 1 g~2 g ） 禽流感诊断的采样需按要求同时采血清及病禽组织样品送样时需附当地动物防疫监督机构的初步诊断意见书（包括畜主姓名、存栏数量、病症始发时间、发病禽种、发病日龄、发病和死亡数量、临床症状、剖检变化、疫苗使用情况、治疗经过等流行病学基本情况）等材料。

样品送检：以上样品采集后密封冷藏保存,送检前对样品外包装消毒后，连同附带材料，一并送省畜牧局实验室检验在采样过程中，要务必注意人员的自我防护 禽流感监测的采样同时采集肛拭子及血清送样时需附当地动物防疫监督机构的采样单，内容包括畜主姓名、存栏数量、免疫时间、疫苗种类及生产厂家、禽种及用途、日龄、健康状况等基本资料疫点、疫区和受威胁区的监测 封锁扑杀消毒后，对疫区和受威胁区所有养禽场、养猪场采集拭子样品，在野生禽类活动或栖息地采集新鲜粪便或水样，禽类每只采集咽喉和泄殖腔拭子一对，猪采集鼻腔拭子；按每个养殖场采30个（对）拭子，散养动物按每个自然村采集30个（对）拭子，野禽活动或栖息地采集30个样品对采集的样品进行病原分离或RT-PCR检测 强制免疫效果监测 鸡群（30只/群）在疫苗接种前、后（免疫后３周）分别静脉采血3mL，分离血清，按GB/T 18936血凝抑制试验（HI）检测鸡血清HI的抗体水平当鸡HI抗体平均水平小于4log2时，判定为免疫效力低下，应当进行疫苗接种；HI抗体水平大于或者等于4log2时，判定为免疫效力良好封锁令解除后无病监测封锁令解除后无病监测 疫区内重新使用的禽舍中饲养高致病性禽流感非免疫禽，或者设立50只岗哨动物，进行临床症状观察和血清学检测，如果禽群有发病或死亡，应采集死禽样品送检分离病原；血清学检测分别在重新饲养非免疫鸡或设立的岗哨动物后0d、30d和5个月时对感染场、危险接触场和可疑场进行，检测数量按照置信水平为95%，检出率低于5%的数量计算。

禽禽流感样品收样检测程序流感样品收样检测程序收收 样样验收样品及相应资料、登记、编号、填写流转单委托检验（检测）委托检验（检测）抽抽 检检仲裁检验仲裁检验流转单、样品交相应实验室复核人复核检测方法、原始记录检验员检验、填写原始记录检测报告编制检测报告审核检测报告核准、签发出具检测报告出具检测报告送达防疫监督部门、送样单位（人）实验室检测技术病毒分离与NASBA的比较NASBA＋NASBA－病毒分离鉴定＋91病毒分离鉴定－22病毒分离与PCR的比较RT－PCR＋RT－PCR－病毒分离鉴定＋16病毒分离鉴定－00荧光RT—PCR技术 本方法为国家标准理论上灵敏度较高，本方法为国家标准理论上灵敏度较高，但本实验室尚未应用其基本原理与但本实验室尚未应用其基本原理与RT-PCR相似但结果通过荧光信号来检测，不需要取相似但结果通过荧光信号来检测，不需要取出扩增样品进行电泳检测，对环境污染少通出扩增样品进行电泳检测，对环境污染少通过本方法可以对过本方法可以对H5、、H7、、H9亚型进行鉴定亚型进行鉴定分子生物学检测方法特点：简便、快速、灵敏，无需病毒分离，不需要生物安全三级（P3或BSL-3）实验室设施。

缺点：对操作环境比普通实验室要求高，一些试验成本高目前国内已批准的方法有：1.NASBA2.RT-PCR3.荧光RT-PCR分子生物学实验室基本要求实验室应装备空调系统，干净密闭，带紫外消毒灯每个房间有单独的通风系统实验室尽可能分区，根据功能划分出核酸提取区、基因扩增区、检测区台式高速离心机台式高速离心机数显恒温水浴锅移液器普通、低温冰箱PCR仪NABSA核酸检测系统荧光定量PCR仪核酸电泳系统凝胶成像系统禽流感诊断的结果判定特别要注意与其它病的鉴别诊断切实加强禽流感的监测工作掌握疫情流行病学情况监测重点部位种禽场及周围3公里区域规模化养殖场户养禽密集区域野生禽类监测工作要求要把监测工作作为常规工作，常抓不懈 省、市、县三级合理分工，各尽其责除禽流感主动监测任务，常规监测经费由同级财政安排 谢谢各位！。