pAKT、HIF-1α在胃癌中的表达及与血管生成的关系临床医学论文.doc

pAKT、HIF-1α在胃癌中的表达及与血管生成的关系_临床医学论文 作者：顾晓萌　卢雪峰　王慧　付金栋　季锐　姜大磊　雒燕【摘要】 　　目的: 研究磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(pAKT)、缺氧诱导因1α(HIF-1α)在胃癌中的表达及AKT/HIF-1α途径与胃癌的发生和血管生成的相关性方法: 免疫组化法检测64例胃癌及26例癌旁正常组织中pAKT蛋白和HIF-1α的表达，以CD34标记血管内皮,计数微血管密度(MVD)结果: 64例胃癌组织中pAKT呈阳性表达48例(75%)，HIF-1α阳性表达42例(65.6%)，均显著高于癌旁组织(χ2分别为26.936、15.950，P<0.05)；pAKT、HIF-1α表达与肿瘤的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移显著相关(P<0.05)胃癌及癌旁组织MVD分别为43.5±12.7、26.2±12.3， P<0.05(t=5.614)； pAKT、HIF-1α均阳性患者MVD显著多于pAKT、HIF-1α均阴性者(t=3. 947,P<0.05),pAKT与HIF-1α的表达呈正相关(Pearson r=0.583，P<0.05)。

结论：pAKT蛋白过表达于胃癌组织，AKT蛋白的磷酸化可增强胃癌细胞的侵袭能力，促进胃癌的转移,又可以通过调节HIF-1α的表达促进胃癌新生血管的生成同时检测胃癌组织中pAKT、HIF-1α和MVD的表达状态，对于胃癌的早期诊断和 治疗 有重要的指导价值 【关键词】 缺氧诱导因子1α· 磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶·胃肿瘤·微血管密度　　Relationship between pAKT, HIF-1α expression and angiogenesis in gastric cancer【ABSTRACT】 Objectives: To investigate the expression of pAKT and HIF-1α and to analyze the relationship among AKT/HIF-1α pathway, the angiogenesis and carcinogenesis in human gastric carcinoma. Methods: The expression of pAKT and HIF-1αin 64 gastric carcinomas and 26 normal tissues were evaluated by immunohistochemistry. CD34 immunostaining was used to measure the microvascular density (MVD). Results: pAKT-positive expression was detected in 75% (48/64) of the tumors, HIF-1α-positive expression was 65.6%. The expression levels of pAKT and HIF-1α proteins in cancerous tissues were higher than those in normal tissues (P<0.05). The expression levels of pAKT or HIF-1α were significantly associated with TNM stage, invasion depth, lymph node metastasis or distant metastases (P<0.05). MVD of gastric cancer (43.5±12.7) was much higher than that of normal tissues (26.2±12.3), MVD was much higher in tumor with pAKT(+) /HIF-1α(+) than those in tumor with pAKT(-)/HIF-1α(-) (t=3.947, P<0.05), pAKT expression was significantly correlated with HIF-1α(r=0.583, P<0.05). Conclusion: pAKT is distinctively over expressed in gastric tissues and its phosphorylation may promote the invasion and metastases of gastric cancer. Additionally, it may increase the expression of HIF-1α to promote angiogenesis. Testing the expression of pAKT, HIF-1α and MVD simultaneously may help to early diagnosis and treatment for gastric cancer.【KEY WORDS】 Hypoxia inducible factor 1 α· Phospho-serine/threonine protein kinase·Gastric cancer· Microvascular density　　丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)是一种调节细胞增殖、分化、迁移中具有重要作用的蛋白激酶，处于PI3K/ AKT信号转导通路的核心部位，可在PI3K作用下生成磷酸化AKT(phosphorylated AKT, pAKT)而激活。

pAKT又进一步激活下游因子，参与蛋白质合成、抗凋亡等过程,从而促进细胞的生长和增殖［１］缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)是机体维持氧自稳平衡的核心调控因子，可调控一系列缺氧诱导基因的的表达缺氧以及非缺氧刺激可通PI3K/AKT (protein kinase B,PKB)依赖或相关的途径诱导HIF-1α的表达和活性［２］2006年5月～2006年7月我们通过检测研究pAKT、HIF-1α在胃癌中的表达，探讨AKT/HIF-1α途径与胃癌的发生及血管生成的关系1　资料与方法 1.1　研究对象　收集2005年7月～2006年6月于山东大学齐鲁 医院 经病理确诊的胃癌标本64例及其癌组织和癌旁3cm外正常组织标本26例，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4μm厚切片64例取标本前均未接受放化疗,其中男44例，女20例；中位年龄58.3岁1.2　主要试剂及检测方法　1∶100兔抗人pAKT单克隆抗体（Cell Signaling公司）,1∶50鼠抗人HIF-1α单克隆抗体（Neomakers公司），1∶40鼠抗人CD34单克隆抗体（北京中杉公司）、通用型抗人S-P免疫组化试剂盒（北京中杉公司）。

以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照以前述一抗稀释浓度染色，操作步骤按试剂盒说明书S-P法进行1.3 免疫组化结果判定标准 光镜下以胞质内棕黄色细颗粒为pAKT蛋白表达阳性；胞核及胞质内棕黄色颗粒为HIF-1α蛋白表达阳性高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计1000个阳性细胞数＜10%为(-)，阳性细胞数≥10%为(+)MVD测定参照Weidner［３］方法:呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群均为1个血管计数，但肌层较厚及管腔面积>8个红细胞直径的血管不计数每张切片在100倍光镜下挑选血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野中被CD34染成棕黄色的血管数目，取其平均值为微血管密度（MVD）1.4　统计学处理　数据用x±s表示应用SPSS11.5软件对数据进行χ2 检验、成组设计t检验及Pearson相关分析P<0.05为差异有统计学意义2　结果 2.1　胃癌及癌旁组织中pAKT、HIF-1α蛋白的表达及MVD值　阳性细胞主要为肿瘤细胞，坏死边缘的瘤细胞阳性表达尤为强烈见图1～5)胃癌组织中pAKT表达阳性率为75%(48/64)；癌旁组织中为15.4%（4/26）,胃癌组织中pAKT的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01)；胃癌组织中HIF-1α表达阳性率为65.6%(42/64)，癌旁组织中为HIF-1α阳性表达率为19.2%（5/26）,胃癌组织中HIF-1α表达明显高于癌旁组织(P＜0.01)； pAKT与HIF-1α表达一致符合率为54.7%（35/64) ,两者表达呈显著相关（Pearson r=0.583,P＜0.05)。

CD34阳性表达主要见于癌组织血管内皮细胞胞质中,呈棕黄至棕褐色染色，胃癌组织MVD值显著高于癌旁组织（P＜0.05)详见表12.2　pAKT、HIF-1α蛋白表达与胃癌的关系 pAKT、HIF-1α蛋白阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度无关(P＞0.05)；与胃癌浸润深度、TNM分期及有无淋巴结转移及远处转移显著相关(P＜0.05)详见表22.3 　胃癌组织中的pAKT与HIF-1α蛋白与MVD关系 pAKT、HIF-1α蛋白表达阳性的组织与其表达阴性者的MVD值比较,有显著性差异(P＜0.05 )，pAKT和HIF-1α蛋白均阳性的胃癌组织与pAKT、HIF-1α均阴性的胃癌组织比较有显著性差异(t=3.9470,P＜0.05)；pearson相关分析表明, pAKT与HIF-1α表达呈正相关(r=0.583. P＜0.05)详见表3，图6～83　讨论 PI3K-AKT/PKB信号通路与人类肿瘤的发生 发展 密切相关，该通路调节肿瘤细胞的增殖和活化，其活性异常不仅导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关活化的AKT可磷酸化下游的酪氨酸和色氨酸残基，从而具有抑制细胞的调亡,促进细胞的增殖和生长及运动和侵袭，促进肿瘤血管生成等功能［4］。

缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一,缺氧状态诱导一系列特异性的与血管新生、缺氧代谢密切相关的基因表达,帮助肿瘤细胞适应缺氧环境,在此过程中起关键作用的是HIF-1αHIF-1α作为缺氧条件下细胞应答最基本的调控因子，与肿瘤的发生、预后及治疗反应存在着密切的相关性，PI3K-Akt/PKB信号通路可增强HIF-1α稳定性，使HIF-1α蛋白表达增加［５］本研究显示胃癌中pAKT、HIF-1α的阳性表达率显著高于癌旁组织Itoh等［６］研究发现在结肠癌细胞中pAKT与细胞的黏附、运动、侵袭、转移密切相关Iwao K等[7]在研究胃癌细胞时发现PI3K-AKT/PKB信号通路阻断剂LY294002可明显抑制肿瘤细胞的生长，加速细胞的凋亡，且HIF-1α的表达明显下降在其他肿瘤如胰腺癌、甲状腺癌、大肠癌、卵巢癌和乳腺癌等也均发现AKT的过度活化，提示pAKT在肿瘤细胞恶性行为中起重要的作用[6、8、9]我们研究发现，pAKT、HIF-1α蛋白与肿瘤的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移及远处转移显著相关；癌旁组织中极少表达，且主要表达于癌旁肠上皮化生及不典型增生组织中，提示pAKT、HIF-1α蛋白可能与胃癌的早期发生有关。

pAKT、HIF-1α蛋白表达存在显著的相关性，在胃癌的发生过程中AKT的活化可促使HIF-1α的活化及磷酸化，增加HIF-1α的稳定性，激活下游的靶因子，从而导致肿瘤的发生新生毛细血管的生成是实体肿瘤细胞生长、增殖的必要条件，也是肿瘤侵袭和转移的必要条件，肿瘤的缺氧状态可诱导与血管形成有关的多种细胞因子释放,促进肿瘤的生长和转移研究表明HIF-1α是恶性肿瘤诱导新生血管形成的一个主要。