中和抗体测定.ppt

中和抗体试验中和抗体试验2008-12-15SDEPI e-mail:liyan7516@Tel:0531-82679697病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u目的Ø评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态Ø评价OPV的有效性和免疫效果u适用范围Ø人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定Ø免疫成功率的监测病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u必备材料Ø待检血清（灭活处理）Ø稀释液（MM）Ø细胞悬液5～10×104/mlØ标准血清（WHO CDC/EPI）Ø标准病毒（Sabin ⅠⅡⅢ） （滴度≥106.0CCID50/ml）u必备材料Ø96孔微量板Ø微量可调式移液器Ø无菌吸尖/无菌吸管Ø无菌1.5ml离心管/试管Ø封板胶带ØCO2孵箱病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u待检血清稀释（1∶4～1∶1024）Ø每份待检血清的稀释在Ⅰ型板的第1排进行Ø0.15ml稀释液，加入 0.05ml的血清，吹吸均匀后，将这个稀释度的血清向下一个稀释度移0.05ml，至最高稀释孔吹吸均匀后，弃去0.05ml （在微量板上进行，板子标记和稀释详见附录1）ⅠⅠ型板型板 血清血清1血清血清2血清血清3血清血清4血清血清对对照照1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　血清稀血清稀释释1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　1∶161∶16　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　1∶641∶64　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　1∶2561∶256　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　1∶10241∶1024　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　血清血清对对照照1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　血清稀血清稀释释1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　1∶161∶16　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　1∶641∶64　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　1∶2561∶256　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　1∶10241∶1024　　 ◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　◎◎　　○○　　血清血清5血清血清6血清血清7血清血清8病毒分离技术（四） ——中和抗体测定稀释度稀释度 1 1：：4 14 1：：16 116 1：：64 164 1：：256 1256 1：：10241024稀释液稀释液 0.15 0.15 0.150.15 0.150.15 0.150.15 0.150.15 血血 清清 0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 废废0.050.05     移入它孔移入它孔 （每孔（每孔××5 5）） 0.025 0.025 0.0250.025 0.0250.025 0.0250.025 n待检血清稀释方法示例：病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u待检血清稀释Ø用排枪向第2排孔及Ⅱ、Ⅲ型板的相应稀释度的两排孔中，每孔移入0.025ml，原稀释孔保留0.025ml。

Ø标准血清稀释（根据血清效价而定）•standard serumⅠ: 1∶8000•standard serum Ⅱ: 1∶2000•standard serum Ⅲ: 1∶2000病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u标准毒株稀释（200CCID50/0.025ml） （病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录2、3）u中和试验时所用抗原量过大或过小都会影响血清抗体滴度每次试验应设病毒对照，核 对 所 用 病 毒 剂 量 ， 一 般 应 在 32～320CCID50/0.025ml的用量时其结果才被认可 （病毒滴定对照见附录4）病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u中和作用，Ø向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液0.025ml （200CCID50） （注意型别的区分和对应）Ø轻摇混匀后，放入CO2孵箱，培养2～4小时u加入事先准备好的细胞悬液0.1ml/孔ØHep-2 : 5～10×104/mlu再次摇匀，密封好放在36.5℃培养5～7天病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u对照的设立Ø血清对照（ 1∶4），标准血清和待检血清同时设立Ø细胞对照、稀释液对照Ø100CCID50的抗原对照v每个对照设两孔，血清、抗原的量各为0.025ml/孔，补加稀释液0.025ml/孔，细胞对照孔的稀释液应为0.05ml，然后全部加细胞悬液0.1ml/孔，密封后放34.5℃培养5～7天。

病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u结果判定Ø当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定最终结果 当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中有1孔不出现CPE，该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体滴度 ⅠⅠ型板型板 血清血清1血清血清2血清血清3血清血清4血清血清对对照照1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　◎◎　　◎◎　　○○　　 ○○　　血清稀血清稀释释1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　◎◎　　◎◎　　○○　　 ○○　　1∶161∶16　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　◎◎　　○○　　 ○○　　1∶641∶64　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　 ●●　　1∶2561∶256　　 ●●　　●●　　○○　　●●　　●●　　●●　　●●　　 ●●　　1∶10241∶1024　　 ●●　　●●　　●●　　●●　　●●　　●●　　●●　　 ●●　　血清血清对对照照1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　○○　　 ○○　　血清稀血清稀释释1∶41∶4　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　●●　　●●　　●●　　 ○○　　1∶161∶16　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　●●　　●●　　●●　　 ●●　　1∶641∶64　　 ○○　　○○　　○○　　○○　　●●　　●●　　●●　　 ●●　　1∶2561∶256　　 ○○　　○○　　●●　　○○　　●●　　●●　　●●　　 ●●　　1∶10241∶1024　　 ○○　　○○　　●●　　○○　　●●　　●●　　●●　　 ●●　　血清血清5血清血清6血清血清7血清血清8病毒分离技术（四） ——中和抗体测定CCID50100●●●●●●●●SabineⅠ10●●●●●●●●1●●●●●●●●0.1●◎◎◎◎●◎◎◎◎◎◎◎◎100●●●●●●●●SabineⅡ10●●◎◎●●◎◎●●1◎◎◎◎●◎◎●◎◎◎◎◎◎0.1◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎100●●●●●●●●SabineⅢ10●●●●●●●●1●◎◎●◎◎●◎◎◎◎●0.1◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎◎病毒滴定结果判断示意图100＝1病毒分离技术（四） ——中和抗体测定uSpearsman—Karber公式：LogCCID50=Xm＋1/2d－d（Pi/100） Xm=所用病毒最低稀释度（最高浓度）的对数 d=稀释度系数（倍数）的对数。

∑Pi=各稀释度出现CPE百分数的总和病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u病毒滴定结果的判定ØSabineⅠ： LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+100+25）/100=-2.75ØSabineⅡ： LogCCID50=0+0.5-1×（100+75+25）/100=-1.50ØSabineⅢ： LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+50）/100=-2.00病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u病毒滴定对照结果的判断ØSabineⅠ：取2.75的反对数，即得到攻击病毒的含量：562CCID50/0.025mlØSabineⅡ：取1.50的反对数，即得到攻击病毒的含量：31.6CCID50/0.025mlØSabineⅢ：取2.00的反对数，即得到攻击病毒的含量：100CCID50/0.025ml病毒分离技术（四） ——中和抗体测定u简单的判定是否有效的方法：Ø32～320 CCID50/0.025ml 的对数： 1.505～2.505（1.5～2.5）Ø1.5～2.5的反对数： 31.62～316.2（32～320 CCID50/0.025ml ）题外话u感谢大家多年来对免疫预防工作的支持u新的问题不断涌现，促使我们不断的向前u未来，任重而道远Thank you very much!。