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免疫毒理学免疫毒理学 1  免疫毒理学（immunotoxicology）是研究外源化学物和物理因素等对机体免疫系统的损害作用、生物学机制及其危险度评价与管理，在免疫学和毒理学基础上发展起来的一门毒理学分支学科定义的提出 1984年，国际化学品安全规划署（IPCS）和欧共体委员会（CEC）共同组织了“免疫系统是毒物损伤的靶”的研讨会，会议对免疫毒理学进行了上述定义，并达成共识会议提出了免疫毒性评价必不可少的两个步骤： ※ 药物和化学物对免疫系统毒性的鉴定 ※ 免疫毒性的危险度评价2  各种免疫器官和组织、免疫细胞及免疫分子共同构成了复杂的免疫系统，这是机体免疫功能正常发挥的物质基础 第一节 免疫生物学基础概述3 一、免疫系统的组成及其功能粘膜相关淋巴组织 完整的免疫系统由免疫器官和组织、免疫细胞及免疫分子所组成。

4 免疫系统可以识别自身和非己抗原，对自身耐受，且清除非己，维持内环境的稳定，表现为免疫防御、免疫自稳和免疫监视三大功能 5 （一）免疫器官和组织（一）免疫器官和组织6 ¡骨髓：B淋巴细胞发育成熟的场所¡胸腺：由胸腺基质细胞和胸腺细胞组成是T淋巴细胞尤其是αβ+T细胞发育的场所胸腺基质细胞与胸腺细胞的相互作用，对T细胞的发育是至关重要的7 ¡脾脏 T：35%、B：55%Mφ：10%¡淋巴结 T：75%、B：25%8 ¡粘膜相关淋巴组织粘膜相关淋巴组织 在呼吸道、肠道及泌尿生殖道的黏膜上皮细胞下，均聚集有无包膜的淋巴组织在小肠黏膜上皮细胞间存在一类T细胞称上皮淋巴细胞。

即： αβ+T αβ+T细胞细胞——特异免疫应答；特异免疫应答； γδ+Tγδ+T细胞细胞——固有免疫应答固有免疫应答9 （二）免疫细胞（二）免疫细胞 免疫细胞（immunocyte）广义地指对抗原物质产生特异性和非特异性免疫应答的各种细胞大体上分为免疫活性细胞、辅佐细胞和其它细胞三类 10 1．免疫活性细胞（immunoconpetent cell, ICC）¡指能识别特异性抗原以及受抗原刺激后向母细胞转化、分裂增殖并分化为能产生免疫效应物质（如抗体、淋巴因子）的淋巴细胞群，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞11 淋巴细胞淋巴细胞（（Lymphocyte）） 分B细胞和T细胞，分别来源于骨髓和胸腺在机体免疫应答中起核心作用¡B淋巴细胞：表面的BCR及分泌的抗体均为免疫球蛋白由B细胞介导的免疫称为体液免疫¡T淋巴细胞：TCR为双链分子。

细胞毒性T细胞、调节性T细胞（辅助性T细胞和抑制性T细胞）12 13 人类人类T细胞亚群及其功能细胞亚群及其功能亚群MHC限制表面标记主要功能TH1MHC-II类限制TCR+、CD3+、CD4+分泌以IL-2、 IFN-和TNF-为主的细胞因子，引起炎症反应或迟发行超敏反应TH2MHC-II类限制TCR+、CD3+、CD4+分泌以IL-4、5、6、10等为主的细胞因子，诱导B细胞增殖、分化、合成、分泌抗体，引起体液免疫反应TcMHC-I类限制TCR+、CD3+、CD8+可特异性的杀死带有致敏抗原的肿瘤或病毒感染的细胞，发挥细胞免疫效应TsMHC-I类限制TCR+、CD3+、CD8+释放抑制性细胞因子(如IL-4、IL-10等)和IFN-  ，抑制体液和细胞免疫发生和发展.14 B 淋淋 巴巴 细细 胞胞始祖B细胞前B细胞不成熟B细胞成熟B细胞来于骨髓淋巴样干细胞，无smIg表达， CD19+无smIg表达，但胞浆中出现链，同时有MHC-II表达，CD19+、20+膜表面出现单体IgM，开始表达CD21，CD19、20、MHC-II类分子表达量增多表达smIgM、 smIgD、IgGFc-R、C3bR、丝裂原受体及CD19、20、21等无免疫应答功能smIgM同自身抗原结合可产生抑制信号，导致自身反应性B细胞处于无功能抑制状态，产生自身耐受具有接受抗原的刺激并发生增殖分化的能力，是抗体产生的源泉细胞；其中部分可成为记忆性B细胞15 16 主要抗原呈递细胞的比较APC主要特征分布分布简称简称C3bRFcRMHC分子吞噬B细胞朗罕氏细胞并指状细胞树突状细胞巨噬细胞BCLCIDCDCM外周血、淋巴结、脾表皮组织某些上皮层淋巴组织、胸腺依赖区淋巴滤泡全身细胞和组织+----+++++++++++++--2．辅佐细胞（accessory cell，A细胞） ¡在免疫应答中呈递抗原，又称抗原呈递细胞（antigen presenting cell；APC），主要有树突细胞（DC）、单核细胞和巨噬细胞。

B细胞是抗原特异性呈递细胞 17  扫描电镜显示：扫描电镜显示：在感染早期，在感染早期，M 伸出长长的伸出长长的伪足去捕获细菌伪足去捕获细菌M 吞噬处理入侵细菌及提呈抗原的机制吞噬处理入侵细菌及提呈抗原的机制18  来源来源：骨髓 分布分布：外周血和淋巴组织 标志标志：CD16、CD56 特征特征：胞浆中含丰富的嗜天青颗粒，又称大颗粒细胞 功能功能：非特异性杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，在早期抗病毒感染、清除突变细胞的免疫监视和免疫调节过程中发挥作用其杀伤作用无需抗原致敏，不受MHC限制3．其他免疫细胞NK细胞 LAK细胞 在IL-2的作用下，体外培养的淋巴细胞才能发挥强烈的杀伤功能，也叫淋巴因子激活的杀伤细胞能杀伤Tc、NK不敏感的肿瘤细胞19 单 核 吞 噬 细 胞 包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞，具有重要的抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用。

一）表面标志：表面抗原：高表达MHC-I/II类分子表面受体：IgG Fc受体，包括高亲和力的FcεRI、中亲和力的FcεRII和低亲和力的FcεRIII作用：参与调理和ADCC补体受体（CRI），为C3b受体，与吞噬和免疫黏附作用有关20 单核吞噬细胞生物学功能 1、吞噬杀伤作用：直接吞噬、调理吞噬作用2、抗原提呈作用：即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后，与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽－MHC分子复合物，并被呈递到细胞膜表面，被TCR识别的作用具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC） 巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA-1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，为T细胞的活化提供第二信号3、抗肿瘤作用：Mφ被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞，其吞噬杀菌能力也显著提高4、分泌生物活性介质，产生免疫应答和其它免疫效应：如IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。

21 （三）免疫分子（三）免疫分子免疫球蛋白（immunoglobulin；Ig）补体（complement；C‘）细胞因子（cytokine；CK）HLA分子22 二、免疫应答过程及其病理反应二、免疫应答过程及其病理反应免疫应答（immune response）是机体非特异性和特异性的识别并排除异己成分以维持自身稳定的全过程，因而免疫应答是整个免疫学的核心非特异性免疫应答指吞噬作用和炎症反应，特异性免疫应答是指细胞免疫应答和体液免疫应答抗原刺激T／B细胞产生致敏T细胞和／或抗体称正应答，未产生致敏T细胞或抗体的为负应答即耐受，抗原还可诱导T／B细胞凋亡免疫应答维护了内环境的稳定，因而是保护性的，但不适当的应答也会导致病理性损伤23 （一）免疫应答的三个阶段 1.启动阶段 指T细胞或B细胞对APC呈递的抗原识别阶段主要包括抗原呈递、T细胞对抗原和MHC的识别、B细胞双识别、T细胞活化的双信号和B细胞活化的双信号等重要环节。

2.诱导阶段（1）T细胞活化、增殖和分化 （2）B细胞活化、增殖和分化 3.效应阶段（1）T细胞介导的细胞免疫效应 （2）抗体介导的免疫效应 24 （二）免疫应答的病理反应（二）免疫应答的病理反应¡异常的免疫反应主要包括免疫抑制与免疫增强两种情况¡免疫增强是指机体过度的或不适当的免疫反应状态过度的或不适当的免疫应答可导致机体各种病理损害，有关的疾病主要有超敏反应和自身免疫性疾病等25 1.超敏反应¡指机体再次接触同一抗原时所发生的不同形式的免疫病理损害过程超敏反应的发生往往取决于外来物质作为抗原的特异性和机体反应的特性两大因素¡超敏反应的类型26 Comparison of hypersensitivity reactions27 28 I型超敏反应的基本过程29 30 31 32 33 Type IV hypersensitivity the three forms34 2.自身免疫反应¡自身免疫反应是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体或/和自身致敏淋巴细胞，引起机体病理损害甚至导致疾病的过程。

¡器官特异性自身免疫性疾病 ¡器官非特异性自身免疫性疾病又叫全身性或系统性自身免疫性疾病 35 第二节第二节 免疫毒性作用及其机制免疫毒性作用及其机制 外源化学物和物理因素可以直接损伤免疫器官和组织、免疫细胞的结构和功能，影响免疫分子的合成、释放和生物活性，或通过干扰神经内分泌网络等间接作用，使免疫系统对抗原产生不适当的应答，即过高或过低的应答，或对自身抗原的应答，都会导致免疫病理过程，发展为免疫性疾病Ø应答过低可引起免疫抑制(immunosuppression)，使宿主对病原体或肿瘤的易感性增加，严重时表现为免疫缺陷；Ø应答过高则表现为超敏反应（hypersensitivity）；Ø自身抗原应答细胞被激活则引起自身免疫(autoimmunity)¡外源化学物对免疫系统的影响常常是复杂的 36 一、免疫抑制免疫抑制 免疫抑制的结果是机体抵抗力降低，主要表现为抗感染能力降低和肿瘤易感性增加 具免疫抑制作用的外源化学物种类繁多 外源化学物引起免疫抑制的机制较为复杂，仅就其作用方式而言，通常分为直接作用和间接作用两大类。

37  外源化学物对神经-内分泌-免疫系统网络某一环节的损害，都可能影响正常的免疫功能 外源化学物免疫损伤的分子机制: 转录核因子（NF-κB）或活化的T细胞核因子（NF-AT）是免疫应答过程中重要的免疫调节因子 外源化学物还可以通过氧化应激反应、破坏细胞内钙稳态、抑制cAMP等机制影响淋巴细胞的正常功能，引起免疫抑制 38 二、超敏反应二、超敏反应¡外源化学物引起的超敏反应同样涉及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型反应类型¡能引起超敏反应的外源化学物或混合物有数百种，可来自食物、药物，也可以从职业或生活环境中接触¡化学物引起超敏反应机制 u 外源性化学物本身作为抗原或半抗原引发超敏反应 u 改变抗体免疫应答的敏感性或强度而导致超敏反应 39 三、自身免疫三、自身免疫¡很多能诱发Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型超敏反应的外源化学物都可以引起自身免疫，尤以药物多见。

¡外源化学物引起自身免疫的机制 （1）引发机体针对自身抗原产生自身抗体进行免疫应答 （2）引发机体产生针对自身抗原的自身应答性T细胞进行免疫应答 （3）造成自身隐蔽抗原的暴露或释放、改变自身抗原或形成新的自身抗原，从而引起自身免疫 （4）改变血细胞或其他组织细胞的抗原性，这种改变了的抗原刺激机体产生自身抗体 （5）影响正常免疫调节功能，如激活对自身抗原处于耐受态的T细胞，或通过APC表面辅助刺激因子异常表达，或引起Th1和Th2功能失衡，引起自身免疫 40 ¡免疫缺陷（immunodeficiency, ID），是指因先天性或继发性免疫系统功能不全的疾病这主要源于抗体缺陷、细胞免疫缺陷、巨噬细胞缺陷或补体系统缺陷发生免疫缺陷的主要原因是先天性免疫系统遗传基因异常 ¡能引起免疫抑制作用的外源化学物多数可能导致机体免疫缺陷的发生影响其发生的主要因素是化学毒物作用的剂量、持续时间和机体免疫应答状况等¡妊娠期或围生期接触外源化学物会严重影响胎儿出生后T细胞、B细胞、吞噬细胞的发育、迁移、归巢及其功能，可能暂时或永久性地损伤机体的免疫系统。

41 第三节第三节 免疫毒性作用的试验方法与评价免疫毒性作用的试验方法与评价一、检测方案一、检测方案（一）美国（一）美国NTP推荐的啮齿类动物（多用雌性推荐的啮齿类动物（多用雌性小鼠）免疫毒性检测方案小鼠）免疫毒性检测方案（二）（二）WHO推荐的人群免疫毒性检测方案推荐的人群免疫毒性检测方案（三）美国（三）美国FDA/ CDER的新药免疫毒理学评价的新药免疫毒理学评价规范规范42 美国NTP推荐的小鼠免疫毒性检测方案（USNTP,1988） 检 测 项 目检 测 内 容筛选（一级） 免疫病理血液学—白细胞总数及分类脏器重量—体重、脾脏、胸腺、肾脏、肝脏细胞学—脾脏组织学—脾脏、胸腺、淋巴结 体液免疫对T淋巴细胞依赖抗原（RBC）IgM抗体生成细胞数对有丝分裂原LPS的反应 细胞免疫对有丝分裂原ConA的反应及混合淋巴细胞反应 非特异性免疫NK细胞活性全面试验（二级） 免疫病理脾脏T、B淋巴细胞数体液免疫对T淋巴细胞依赖抗原（SRBC）IgG抗体生成细胞数细胞免疫细胞毒T细胞的溶细胞作用（CTL）迟发型变态反应（DTH）非特异性免疫巨噬细胞功能宿主抵抗力对不同肿瘤和感染因子的抗性（选择2～3种）43 WHO推荐的人群免疫毒性检测方案（WHO，1992） 检 测 项 目检 测 内 容全血细胞计数及分类 体液介导免疫（检测一项或多项） 对蛋白抗原的初次抗体反应；血清中免疫球蛋白水平（IgM、IgA、IgG、IgE）对蛋白抗原的二次抗体反应（白喉、破伤风或脊髓灰质炎）对回忆抗原的增殖反应。

细胞免疫 用试剂盒检测皮肤迟发型过敏反应对蛋白抗原（KLH）的初次DTH反应对血型抗原的天然免疫（如抗A、抗B）自身抗体和炎症C-反应蛋白自身抗体滴度对过敏原产生的IgE水平流式细胞仪分析淋巴细胞表型 分析淋巴细胞表面标记CD3、CD4、CD8、CD20 非特异性免疫的检测 NK细胞数（CD56或CD60）或对K52细胞的溶解活性吞噬作用（NBT或化学发光）临床化学指标检测 44 美国FDA/ CDER的新药免疫毒理学评价规范(2002) 提出要考虑药物对免疫系统五个方面的影响，除了免疫抑制、超敏反应和自身免疫外，还有免疫原性（immunogenecity）和不良免疫刺激（adverse immunostimulation）前者指药物及其代谢产物引起免疫反应的能力，后者指药物对免疫系统某些成分的任何抗原非特异性的、不适当的或难以控制的活化作用，并指出可根据不同药物的特点和具体情况灵活选择合适的参数项目和评价 45 二、检测方法二、检测方法 （一）免疫病理学检查（一）免疫病理学检查 观察免疫器官的大小（重量）和大体形态，然后进行组织病理学检查 主要观察胸腺、脾脏、淋巴结和骨髓的组织结构和细胞类型，同时要注意检查局部粘膜相关淋巴组织¡一般先用常规染色法染色，根据需要再选择免疫组化等特异性方法¡利用荧光标记单克隆抗体和流式细胞仪观察淋巴细胞表面标记是目前检查淋巴细胞表型的可靠方法，而以往多采用直接或间接免疫荧光法46 （二）免疫功能检测（二）免疫功能检测固有性免疫应答评价固有性免疫应答评价 1．．NK细胞活性测定细胞活性测定 观察NK细胞对敏感的肿瘤细胞的溶解作用 LDH释放法 2．巨噬细胞功能检测巨噬细胞功能检测 同位素铬标记鸡红细胞（51Cr-cRBCs）吞噬法 炭粒廓清试验、巨噬细胞溶酶体酶测定、巨噬细胞促凝血活性测定、巨噬细胞表面受体检测 47 适应性或获得性免疫应答评价3．体液免疫功能检测．体液免疫功能检测 用特异性抗原免疫动物，刺激脾B细胞活化并分泌抗体，然后观察抗体生成量或抗体形成细胞数 前者可用ELISA、免疫电泳法、血凝法等直接测定血清抗体浓度，后者常用空斑形成细胞（PFC）试验 4．细胞免疫功能检测．细胞免疫功能检测 细胞毒性T细胞杀伤试验（CTL） T淋巴细胞增殖试验 迟发型超敏反应（DHR） 宿主抵抗力试验宿主抵抗力试验48 （三）免疫细胞因子的检测（三）免疫细胞因子的检测各种细胞因子（受体）检测方法的比较 49 （四）超敏反应和自身免疫反应检测（四）超敏反应和自身免疫反应检测¡Ⅰ型超敏反应—被动皮肤过敏试验（PCA）—主动皮肤过敏试验（ACA）—主动全身过敏试验（ASA） ¡Ⅳ型超敏反应 —Buecher试验（BA）—豚鼠最大值试验（GPMT）—豚鼠迟发性皮肤超敏反应（DHR） ¡目前还没预测Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应的标准试验方法。

50 （五）其他检测方法的应用（五）其他检测方法的应用¡分子生物学技术与方法¡转基因/基因敲除动物模型¡重症联合免疫缺陷小鼠模型¡计算毒理学方法的应用 重症免疫联合缺陷小鼠（重症免疫联合缺陷小鼠（SCID mice）是一种近交系）是一种近交系CB-17的自的自发突变体小鼠发突变体小鼠T、、B细胞均缺失，不产生免疫应答和肿瘤排斥反应，细胞均缺失，不产生免疫应答和肿瘤排斥反应，因而是接受外源移植物的极好宿主用人的免疫细胞移植这些小鼠，因而是接受外源移植物的极好宿主用人的免疫细胞移植这些小鼠，从而使这些小鼠在一定程度上可获得人的免疫功能这些人源化小从而使这些小鼠在一定程度上可获得人的免疫功能这些人源化小鼠则可用于检测化学物的免疫毒性作用鼠则可用于检测化学物的免疫毒性作用51 三、评价三、评价¡免疫系统组成和功能十分纷繁复杂，外源化学物的免疫毒性作用常表现出双向性、选择性、多样性等特点，因此，外源化学物免疫毒性作用评价问题也颇具复杂性。

52 。