子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,病理新技术在子宫颈,CIN,的应用,河南省人民医院病理科,,孔令非,,病理学新技术,FISH,,原位杂交,,免疫组织化学,,生物传感器,,,,荧光原位杂交,,Fluorescence in situ hybridization,,,原理,,利用,DNA,碱基对的互补性，将,直接,标记了荧光的单,,链,DNA(,探针,),和与其互补的目标样本的,DNA(,玻片上,,的标本,),杂交,,,通过观察荧光信号在染色体上的位,,置反映相应染色体的情况,FISH,,FISH,操作,样本预处理,,,脱蜡，脱水及水化，消化，,,探针、样本变性,,,78,℃,,探针＋样本杂交,,,45-50,℃,,杂交后洗涤,,,结果观察,,FISH,探针种类,,CSP,着丝粒探针,,GLP,特异性位点探针,,染色体整臂探针,,FISH,探针的类型,,全染色体涂抹探针 （,WCP,）,,,染色体计数（着丝粒）探针（,CSP,）,,,位点特异性探针（,GLP,）,,单色特异性探针,,双色分离重排探针,,双色双融合易位探针,,,,IgH,Bcl2,IGH,/,BCL2,探针,14（灰）号和18号（黑）染色体,IgH,基因,Bcl-2,基因,杂交,正 常,,异 常,融合,基因扩增,双色双融合易位探针,(,IGH/BCL2,）,,,FISH,的特点,操作简单 检测快速 结果易观察,,,灵敏性和特异性高,,,可检测样本种类多,,,空间定位精确,,,,,,,FISH,检测在临床中的应用,产前诊断,,,血液病检测,,,实体瘤检测,,端粒，端粒酶及作用,端粒是真核细胞染色体末端的特殊,NDA-,蛋白结构，其,DNA,含大量,TTAGGG,重复序列，在进化中高度保守,,DNA,酶不能复制线性,DNA,（端粒是线性,DNA,）,,大多数体细胞的端粒会随周期性复制而缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止；许多肿瘤细胞端粒酶活性增高，是肿瘤细胞增殖的关键步骤,,作用：,,保护染色体基因组免受降解或重组,,为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列，以缓解或取消末端复制所带来的染色体,DNA,进行性缩短,,生殖细胞具有端粒酶活性，其端粒不随年龄增加而缩短，故成为永生细胞,,,,端粒酶由,RNA,，,DNA,及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶,,端粒酶活性决定于端粒酶,RNA,（,human telomerase RNA,,hTERC,),和端粒酶催化亚单位,(human telomerase reverse transcriptase,,hTERT,),,hTERC,是端粒长度稳定的直接因素,,保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期有活性和潜在的继续增殖能力,,人端粒酶基因位于,3q26.3,，该基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生,,宫颈脱落细胞及组织学,FISH,探针,CSP3,TERC,hTERC,基因定位于,3q26.3,,3,号染色体着丝粒信号,,All the three centers obtained similarly increasing trend of,hTERC,positive rates according to the severity of cervical lesions, for both cytological results and pathological diagnosis.,,中国,8350,例子宫颈病变,TERC,扩增,TBS,分级,正常,/,炎症,ASCUS,ASC-H,LSIL,HSIL,TERC,基因扩增发生率（,%,）,4.6,13.5,28.6,25.2,87.7,病理分级,正常,/,炎症,CIN 1,CIN 2,CIN 3,浸润癌,TERC,基因扩增发生率（,%,）,4.2-10.6,26.8,65.4,83.1,93.5,,hTERC,检测临床意义,伴有,hTERC,基因扩增的癌前病变的病人有,52%,－,96%,的恶变可能。

可预测,CIN1/CIN2,向,CIN3,发展的风险因素，其灵敏度是,100%,， 特异性是,70%.,,,FISH,是早期诊断和风险预测的有效手段,(AJP April 2005, Vol. 166, No. 4),,,hTERC,基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值,,魏丽惠，李亚里，吴瑞芳，陈忠，屠铮，江静，李静然,,北京大学人民医院妇科，北京，中国,,中国解放军总医院妇科，北京，中国,,北京大学深圳医院妇产科，深圳，中国,,犹他大学医学遗传学科，盐湖城，美国,,,该研究显示，采用,FISH,技术检测,hTERC,基因扩增可在宫颈细胞学玻片上进行，具有无创性和客观性的特点，敏感度和特异度高，在宫颈癌和宫颈癌前病变的诊断中有重要价值hTERC,基因的异常扩增可能成为宫颈病变恶性进展的早期标记物北京协和医院郎景和教授点评：,,,在液基细胞学检查和检测人乳头状瘤病毒筛查宫颈癌的同时，检测,hTERC,基因，有望成为协助宫颈癌和宫颈癌前病变诊断及预测癌前病变是否向子宫颈癌发展的重要指标，而造福广大妇女细胞非典型性发育异常,细胞癌变,阻止细胞正常凋亡,高危型,HPV,持续性感染,人类染色体端粒酶基因,(,hTERC,),扩增,致癌基因,E6/E7,编码的原癌蛋白表达,TERC,基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生,,P16,表达,E7,结合,RB,E6,结合,p53,,,随着宫颈病变级别增加，,hTERC,的阳性率增加,,,hTERC,阳性率,,正常或炎症组,4.2-10.6%,,CIN1,组,26.8%,,,CIN2,组,69.23%,,CIN3,组,83.58%,,宫颈癌组,95.65%,正常及,CIN1,的,hTERC,基因阳性率明显低于,CIN2,及以上者，,P,<0.01,,,,hTERC,诊断,CIN2,或,CIN2,以上病变,,敏感度,81.40%,,特异度,95.04%,,阳性预测值,70.00%,,阴性预测值,97.29%,,,,,,Human,Papilloma,,Virus(HPV,),环状双链,DNA,病毒,,超过,120,种亚型,,其中的,72,种亚型可引起肛门及生殖器疾病,,Low risk (LR-HPV):,6,11,,40,42,44,54,61,70,72,81,,High risk (HR-HPV):,16,18,,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,82,,,HPV,的生物学状态,:,游离或整合,在,HPV,感染的早期或瞬间感染，,HPV,基因组以游离的环状,DNA,形式存在于宿主细胞核中。

Condyloma,and CIN-1),,持续的,HPV,感染，使其,DNA,整合进宿主,DNA,，标志着恶性转化CIN2,＋,lesions),,,持续性的,HPV,感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带、肛门和口咽）,,HPV,通过宫颈,鳞腺交界处,感染基底细胞,,或,HPV,通过微创伤直接感染基底细胞,,临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病变本身,,HPV,检测及预后预测价值,阴性预测价值,(NPV),约,,~99%,,women not infected with HR-HPV have <1% chance to have HSIL lesion,,阳性预测价值,(PPV),根据患者的年龄,:,,<30: PPV is only 20% even persistent HPV,,>30: PPV gradually increased with age and persistent HPV infection,,原为杂交法,用标记的,HPV,探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，并进行显色,,特异性最强,,敏感性高,,直观,,可结合组织学或细胞学形态,,探针有：,6/11, 16/18, 31/33,,导流杂交法,扩增所取样本的,DNA,,放在固定好基因探针的基因芯片上（,21,种亚型包括,13,种高危亚型,16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68,及,5,种低危亚型,6, 11, 42, 43,44,和,3,种中国人群常见的亚型,53,66,CP8304,型进行杂交,,探针标记,Biotin,及碱磷酶,,用,NBT/BCIP,进行显色,,结果呈蓝紫色,,判定标准－,RLU/Cutoff,,的比值,,≥,1 =,阳性,, 50,以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，但,>50,的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。

＜,1 =,阴性，表示未检出,13,种高危型,HPV DNA,序列或标本中不含有高危型,HPV DNA,序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限度以下，不能除外潜伏感染；,,如果接近但小于,1.0,且被怀疑有高危型,HPV,感染，应该重新采集标本HC-II,的应用条件,HPV test,不适用的情况：,,细胞学显示异型增生时,,年龄,<30,岁，除非细胞学显示,ASC-US,,男性外生殖器,,HPV test,应用条件：,,ASC-US,,>30,岁的女性,,,细胞学检查结合,HPV test,,HPV,检测方法的比较,,原位杂交,导流杂交,基因捕获,HC-II,原理,在原位进行,HPV DNA,的杂交,提取,DNA,进行,PCR,，进行膜杂交,DNA,分解，,DNA-RNA,杂交，抗体捕获，,特点,组织学及细胞学涂片上原位显示分型,HPV,具体分型显示,HPV,,无病毒负荷的提示,只显示高危病毒感染，不具体分型，可提示病毒的负荷,敏感性及特异性,敏感性,+,,特异性,+++,敏感性,+++,,特异性,+,,敏感性,+,,特异性,++,取材,组织或细胞涂片,阴道分泌物,阴道分泌物,,生物传感器技术,24,种,HPV,亚型，其中低危,8,种（,6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 70,），高危,16,种（,16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ,81,）,,可检测,HPV,的载量,,子宫颈细胞中,HPV,的情况,,,,单独感染,,,混合感染（,2,、,3,，～,6,种,HPV,型）,,,子宫颈鳞状上皮病变中,HPV,感染,,HPV,检出率,1,,(,导流杂交）,病毒种类,1,HR-HPV,检出率,2,,（,HC-II),尖锐湿疣,92%,6,11,31,52,,低级别,CIN,89%,16,31,18,52,33,6,11,74.93%,高级别,CIN,100%,16,33,52,18,91.72%,鳞状上皮增生,33%,6,11,16,18,43.29%,1.,北京军区总医院病理科,,2.,解放军总医院妇产科,,CIN,中需注意的问题,CIN,病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显著的不典型增生，而非基底层细胞，是,CINI,的病理基础,,CIN,病变累及腺体,,一般：鳞状上皮,CINIII,，进一步向下发展延伸至腺体，但未突破基底膜,,少数：鳞状上皮,CINII,，腺体鳞化也呈,CINII,，这时为表达腺体的改变，诊断为,CINII,累及腺体,,个别：在腺体鳞化的基础上出现不典型增生，甚至出现的不典型增生的程度超过表面鳞状上皮,,,绝大多数的,HPV,感染可回退,Spontaneous,,regression,,Spontaneous,,regression,Cancer,High-grade dysplasia,Low-grade dysplasia,Subclinical HPV infection,US Cases,300,000,11,000,1,400,000,30,000,000,,HPV infection,Cervical Cancer,,,Spontaneous,,regression,,持续性,HPV,感染导致,CIN2-3,,LSIL,一般由瞬间,HPV,感染引起,,HSIL,发生在那些持续性,HR-HPV,感染,2,年以上的患者,,大多数年轻的女性,(<30 yrs),的,HPV,感染为暂时性的，将被自体免疫系统清除,,HPV,持续性感染一般发生在老年女性,,HPV,感染与机体免疫反应,阴道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗体，酸性环境及锌离子等组成第一道防线,,子宫颈鳞状上皮（复层上皮）形成天然屏障，组成第二道防线,,内在的非特异性免疫防御系统即炎症反应，构成第三道防线,,局部的细胞免疫监视，可启动接触性级连反应，放大传递信号，形成针对壳蛋白,L1,的特异性细胞免疫反应,,大多数的,HPV,感染细胞将成为,HPVL1,抗原递呈细胞；细胞毒,T,淋巴细胞和辅助,T,淋巴细胞可识别此细胞，并通过免疫监视和免疫清除杀灭细胞,,,CytoReact,,,用敏感的非同位素核酸杂交和免疫组织化学及免疫细胞化学的方法检测子宫颈细胞中,HPV L1,蛋白的存在，可用于细胞学涂片，组织学切片的检测。

广谱的,HPV L1,抗体可识别大多数的,HPV L1,蛋白（,,6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56,，,58,）基本原理特点,多聚物微球结合非同位素标记,HPVL1DNA,探针与多聚酶混合物（固态杂交液）,,解链及杂交过程与抗原修复过程合并,,标记物为碱性磷酸酶，底物为,AEC,,原为杂交与免疫组化反应颜色重叠，提高敏感性,20-30,倍,,可检测出,0.01pgHPV L1,蛋白,,细胞核阳性表达（核膜及核）,,,HPV L1,的存在表明,HPV,病毒感染处于游离状态或瞬时感染期,,HPV L1,阳性与异常细胞学的回退密切相关,,在,HPV(+),的病人中，,HPV L1,的缺失，提示存在,HPV,的持续感染，并有向高级别,CIN,发展的趋势,,特别有意义的是，在,HR-HPV(+),的病人中，,HPV L1,阳性提示,HPV,以游离状态存在，发生高级别,CIN,的机率极低,HPV L1,检测的临床意义,,,p16,检测的意义,p16,是,cyclin,依赖性激酶抑制剂，抑癌基因，可抑制,CDK4,、,CDK6,活性，降低,RB,的磷酸化，增强,RB,的功能，抑制,E2F-1,的释放，从而抑制细胞周期,,E7,结合,RB,，释放,E2F-1,，促使细胞周期,,E2F-1,的聚集（,RB,的磷酸化的结果）导致,p16,的增加,,p16,的高表达提示,HPVE7,的存在,,小 结,CIN,的发生及发展与,HPV,的感染直接相关,,HPV ≠ CIN,,CIN = HPV,,CIN,分为：,CIN I,、,II,、,III,；,TBS,：,Ascus,, LSIL,，,HSIL,,临床常用的,HPV,检测方法（,HC-II,，导流杂交）,,阴道小环境的,HPV,感染状况,,间接代表子宫颈,HPV,感染状况,,不知,HPV,的,生物学,存在状况,,生物传感仪检测子宫颈组织和细胞中的,HPV,类型,,TERC,基因扩增表明细胞的增殖活性增强，提示病变向恶性发展的原动力存在,,p16,的检测可提示,HR-HPV,感染，并整合宿主,DNA,,子宫颈组织和细胞中,HPV L1,检测阳性，提示机体免疫可清除,HPV,病毒感染细胞，使,CIN,病变向良性发展,,,,液基薄层细胞制片技术,,真空负压吸引，膜式采集技术,,重力沉降技术,,离心沉降技术,,其他,,特点：,,标本保存时间长，更完整，结构更清晰,,细胞数量更多,,细胞平铺，不重叠,,更利于观察，不易漏观察,,可重复制片,,,应用范围：,,子宫颈细胞学检查,,体液细胞学检查（胸腔积液、腹腔积液、尿液、脑脊液及灌洗液等）,,分泌物细胞学检查（痰液）,,优势：,,明显提高阳性细胞检出率,,前提：,,具备丰富诊断经验的病理医师是关键,,国外细胞学医师需要获得医师资格证、病理医师资格证以后，再经过,2-3,年的专科培训才能从事细胞学诊断，并担负相应法律责任,,国内正在规范，从事细胞学诊断必须有医师资格证并注册到病理诊断,,,,1988,年，美国国家癌症研究所在马利兰州的,Bethesda,召开了病理细胞学会议，提出子宫颈细胞学报告的新分类，即,Bethesda,报告系统（,The Bethesda,System,TBS,）,,T,he,B,ethesda,s,ystem for Reporting Cervical,Cytology(TBS,),根据,2001,年第三届国际,Bethesda,工作会议要求,,由著名细胞病理学家,Solomon,和,Nayar,编著,,是目前有关子宫颈细胞学分类和诊断标准中最新，最权威的,,该系统的,3,个基本原则：,,在不同病理学家及病理科必须是统一的，可重复的，并富有灵活性,,能反映对子宫颈肿瘤的最新认识,,能将病理的有关临床信息传递给患者,,,TBS,的改变是基于临床的进展和对宫颈癌生物学行为研究的进展,,废弃“诊断,(diagnosis)”,，而使用“判读,(interpretation)”,或“结果,(result)”,一词,,病人的最终诊断及处理方案不仅依靠细胞学结果，还需整合病史、临床发现及其他实验室结果（,ASCUS,HSIL),,细胞学结果只是代表形成最终诊断的一个重要因素,,子宫颈细胞学诊断标准的变迁,20,世纪,40,年代初，巴氏创建了子宫颈细胞学检查方法并提出巴氏分级报告系统,(,以癌为中心,),,20,世纪,50-70,年代，认识了,原位癌和不典型增生,，并分为轻、中、重,,20,世纪,70,年代，,Richart,提出,子宫颈上皮内瘤变,(CIN),，认为不典型增生的细胞在本质上与原位癌的细胞无差异，是同一疾病过程在上皮内连续的、不同程度的病变，两者有共同的病因、生物学特征和自然病程，具有演变为癌的潜能，为浸润癌的前期病变。

TBS,的问题,,TBS,与,TCT,的关系？,,AUS-US,的发现率？,,HPV,，滴虫及霉菌检出阳性率低？,,,,HPV L1,HPV,Cytology Test,HPV,Precancer,Cancer,,子宫颈癌的预防策略,,Currently:,Future??,HPV DNA Test,,Vaccine,Cytology Test,,,,谢谢！,,。