高等植物叶绿素降解的途径.doc

高等植物叶绿素降解的PaO 途径田风霞 1，王玮 2,1 南阳师范学院生命科学学院，河南南阳 473061； 2 作物生物学国家重点实验室/山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271018摘 要：文章介绍植物体内叶绿素降解 PAO 途径研究进展关键词：叶绿素降解；滞绿突变；衰老PaO passway of chlorophyll breakdown in higher plantsTIAN Feng-Xia1, ZANG Jian-Lei1, WANG Wei2,*1College of Life Sciences, Nanyang Normal University, Nanyang, 473061, China; 2State Key Laboratory of Crop Science/College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271018, ChinaAbstract: This paper introduced the research progress of PAO passway of chlorophyll breakdown in higher plants.Keywords: Chlorophyll degradation; Stay-green Mutant; Senescence叶绿素(Chl)，地球上最丰富的色素，是用于吸收光能进行光合作用的一个重要组成部分。

然而，由于其吸收光能的特性，叶绿素也是个危险分子和潜在的细胞毒素这种情况发生在植物的光合机构被过度激活的时候，例如在强光条件下，吸收的能量可以被转移到氧，导致活性氧(ROS)的产生同样，叶绿素的生物合成或降解被抑制也可导致ROS的产生和细胞死亡在叶片衰老过程中Chl不断被分解，原有的类胡萝卜素致使叶片呈黄色而黄化，这是一种从衰老的组织中回收营养的主动过程 [1]正常生长发育的植物中，大部分Chl存在于叶片的蛋白质复合体中，以游离态形式存在的Chl会对细胞造成光氧化损伤为了避免游离态Chl及其有色代谢产物对细胞造成光氧化伤害，植物细胞必须快速降解这些物质因此，叶绿素的代谢是植物发育过程需要精确调节的过程叶绿色的降解主要发生在叶片衰老和果实成熟过程中，虽然叶绿素的生物化学和合成调控被广泛深入的研究但是它对于许多生物和非生物胁迫的响应，仍然不是很理解本研究由国家自然科学基金(30671259) 资助 通讯作者(Corresponding author): 王玮，E-mail: wangw@第一作者联系方式: E-mail: tianwenxiu1984@叶绿素作为自然界最重要的色素之一，其生物合成途径已被研究的相当仔细，而对其降解过程却知之甚少多年来，叶绿素的降解被认为是一个生物学之谜。

1912年Arthur stoll发现叶绿素酶以来，伴随叶绿素的消失，没有发现相应的代谢产物积累，这也许就是为什么叶绿素降解长期被忽视的原因我们现在知道，这些降解产物没有被发现的原因仅仅是因为它们没有颜色在最近几年中，对这些没有颜色的代谢产物结构的鉴定，随着降解产物结构分析和酶基因克隆( 叶绿素酶、脱镁叶绿酸a单加氧酶和红色叶绿素代谢产物还原酶)的成功，逐渐揭示了高等植物衰老叶片中叶绿素降解途径的奥秘叶绿素降解产物的结构解析是了解降解代谢流向的关键在相当长的一段时间内，人们在衰老的叶片中找不到与叶绿素降解有关的衍生物，重要的转折点是1991年Kräutler 等发现了大麦中非荧光叶绿素代谢物(nonfluorescent chlorophyll catabolite from Hordeum vulgare，Hv-NCC-1，图1)Hv-NCC-1的结构提示人们两点：第一、氧化开环是发生在二氢卟吩大环的α-位，而不是先前所认为的δ-位；第二、降解物由叶绿素a衍生而来，因此叶绿素b在植物体内先转化为叶绿素a，再行降解图1 Hv -NCC-1的结构示意图 [2]Fig.1 Structure of Hv-NCC-1[2]大多数学者认同叶绿素降解的关键是脱镁叶绿酸a单加氧酶(pheophorbide a oxygenase，PaO)催化卟啉开环，并因此将叶绿素降解途径称为PaO途径 [3-4]。

因为PAO负责为特征的大环开环反应，出现在下游的是 FCCs和NCCs [5]只有识别和鉴定叶绿素代谢过程中的作为降解的自然产物的关键代谢产物，才能更好的分析高等植物中普遍存在的叶绿素降解途径叶绿素的降解途径可以分为两部分：Chl的分解代谢反应分2个阶段前一个阶段是所有植物所共有的，即Chl 降解成无色的呈蓝色荧光的中间产物(primary fluorescent chlorophyllcatabolite，pFCC) ，这一阶段需要4种酶首先了，Chl 被叶绿素酶催化脱去植醇基形成脱植基叶绿素a，然后由脱镁螯合酶去除镁离子形成脱镁叶绿酸a [6]，接下来脱镁叶绿酸a经过由脱镁叶绿酸a加氧酶和红色叶绿素代谢产物还原酶催化的两步反应转化成pFCC，中间过程形成一种不稳定的中间产物红色叶绿素代谢产物(red chlorophyll catabolite，RCC) 最后，pFCC经过几次修饰之后运输至液泡中在第二个阶段，经过修饰的pFCC在液泡中发生非酶学异构形成最终的非荧光叶绿素代谢产物NCC，这是在液泡的酸性pH 条件下进行物种特异性修饰的过程，最后转化形成单吡咯氧化降解产物将叶绿素代谢产物从衰老的叶绿体转运到液泡是由激活的转运途径来完成的。

本文综述了叶绿素的降解PaO途径研究进展1 叶绿素和含氯色素的反应1.1 叶绿素b到叶绿素a的转变叶绿素a (chlorophyll a，Chl a)和叶绿素b (chlorophyll b, Chl b)是植物体内最为主要的两种叶绿素，Chl b向Chl a的转化可能是叶绿素降解途径的一部分 [7]虽然有报道表明，植物叶片衰老过程中有脱植基叶绿素b (chlorophyllide b，chlide b)的产生，但没有叶绿素b进一步降解产物的形成 [8]分析大麦叶绿素无色无荧光降解产物(non-fluorescent Chl catabolite，Hv-NCC-1)的结构表明，它与叶绿素a脱植基后的结构相似；此外，存在于液泡中的其他叶绿素降解产物的结构均源自叶绿素a，而非叶绿素b [9]脱镁叶绿酸a氧化酶(pheophorbide a oxygenase, PaO)的研究表明，脱镁叶绿酸a (pheophorbide a，pheide a)与PaO的亲和力很高，而脱镁叶绿酸b(pheophorbide b，pheide b)对PaO活性则有抑制作用 [10]据此可以推测，Chl b只有在转化为Chl a，后才能进入降解途径。

至今，在已鉴定的叶绿素降解产物中，除了拟南芥的At-NCC-3 之外，在C-7位上均含有甲基，即叶绿素a的特征性取代基团 [4]，因此叶绿素b向叶绿素a的转化被认为是叶绿素b降解的先决条件这一转化过程由两种酶催化完成，它们是NADPH- 依赖的叶绿素b还原酶和铁氧还蛋白依赖羟甲基-叶绿素还原酶 [11]叶绿素Chl (ide) b参与叶绿素分解被证实是在衰老过程中增加其活性 [12]最近，Chl(ide) b还原酶可以归因于水稻两个短链脱氢酶/还原酶蛋白，称为NON-YELLOW COLORING1 (NYC1)和NYC1-LIKE (NOL)[13-14]2007年Kusaba等 [13]在水稻的持绿突变体中，采用图位克隆技术，克隆了NYC1基因( NON-YELLOW COLORING 1)，结果表明它是编码叶绿体定位并带有3个跨膜结构域的短链脱氢酶/还原酶数据库检索表明它与水稻和拟南芥中的NOL (NYC1-LIKE)高度相似研究者将扩增的NOL片段插入pGEX-3X 质粒，构建谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白，并在大肠杆菌(BL21 DE3)中表达，细胞抽提物与叶绿素b反应后，采用高效液相色谱分析产物羟甲基-叶绿素，证实了NOL的体外叶绿素b还原酶活性。

1.2 脱植醇鉴定Pheide a作为叶绿素分解的中间代谢产物 [10,15]，表明去除中央镁原子和疏水醇侧链的开环反应优于PaO催化的含氯色素反应环的打开多年来，chlorophyllase (CLH)催化叶绿素植醇水解反应发生在脱镁之前，即产生Chlide作为中间代谢产物 [16–17]，有一些报告认为存在一个相反的顺序，即脱镁发生在脱植醇之前，产生Phein作为中间代谢产物 [18,19]并不是所有的推断的CLH基因蛋白定位于在叶绿体 [20]此外，最近的拟南芥中的研究表明解决了这个问题拟南芥中包含两个CLHs，CLH1和CLH2,，但缺失一方或双方各自的突变体蛋白以及RNAi沉默 CLH1的植株，只在叶片衰老的有一点边际效应总的来说，这些数据挑战CLHS在体内叶片的衰老过程中活跃的观点，因此，得出的结论是，在衰老叶绿素降解的过程中CLHs并不是必须需要的 [21-22]By contrast, several investigations in different species support a function for CLHs. For example, antisense suppression of CLH1 of broccoli (Brassica oleracea) in transgenic plants delayed the rate of postharvest Chl breakdown [74]. Furthermore, Citrus CLH was convincingly shown to be active in Chl breakdown during Citrus fruit ripening, and, after heterologous overexpression in squash leaves and tobacco cells, to also promote Chl breakdown in these leaf tissues [75,76].相比之下，在不同的物种中的许多调查支持CLHs的功能。

例如，对clh1花椰菜(Brassica oleracea)反义抑制在转基因植物中的叶绿素击穿延迟采后[ 74 ]率此外，柑橘 CLH令人信服地证明是活跃在柑橘果实成熟过程中的叶绿素的分解，和异源表达后，南瓜叶和烟草细胞，也促进这些叶组织75,76 ] A functional genomics screen in Arabidopsis for alternative phytolcleaving esterases uncovered pheophytinase (PPH), a 50 kDa protein located in the chloroplast stroma [14]. Recombinant Arabidopsis PPH exhibited phytol-cleavage activity, which was specific for Phein. Thereby, both Phein a and Phein b were accepted as substrates, but the enzyme did not dephytylate Chl. This intriguing specificity paralleled the fact that Arabidopsis PPH mutants accumulated significant amounts of Phein during senes。